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中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)是一種新型冠狀病毒，能夠?qū)е聡?yán)重的肺炎，休克及器官衰竭，致死率高達(dá)到30%以上，是繼2002年非典型肺炎(Severe Acute Respiratory Syndromes,SARS)暴發(fā)以來(lái)，出現(xiàn)的又一種感染人類(lèi)的高致病性冠狀病毒[1-2]。MERS-CoV由4種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，包括刺突蛋白(spike protein，S),膜蛋白(membrane protein，M)，囊膜蛋白(envelope protein，E)和核蛋白(nucleoprotein，N)。其中，S蛋白又分為S1，S2兩個(gè)亞基，位于S1區(qū)的受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)主要識(shí)別結(jié)合宿主細(xì)胞，S2亞基含有HR1/HR2，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合的過(guò)程[3]。二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase，DPP4)作為MERS-CoV的受體，也是融合過(guò)程的關(guān)鍵分子[4]。DPP4被S蛋白上RBD識(shí)別結(jié)合后，配合其他功能膜蛋白分子如CD9、TTSP，切割S蛋白，S蛋白構(gòu)象發(fā)生變化后，與宿主細(xì)胞膜融合，病毒顆粒的早期感染由此開(kāi)始[5]。2017年，Yuan 等解析了MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白及RBD融合過(guò)程的動(dòng)態(tài)結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)，論證了位于S蛋白的RBD具有靈活的結(jié)構(gòu)以便識(shí)別結(jié)合受體，而這個(gè)區(qū)域正是廣泛誘導(dǎo)中和抗體的區(qū)域[6-8]。針對(duì)MERS-CoV的中和抗體可以封閉病毒，同時(shí)不影響DPP4的正常生理功能，阻斷RBD與DPP4的結(jié)合，是未來(lái)能夠用于MERS-CoV臨床治療的優(yōu)質(zhì)候選者[8]。因此應(yīng)用中和抗體能夠阻斷RBD結(jié)合受體細(xì)胞的原理，從而建立無(wú)病毒檢測(cè)MERS-CoV中和抗體的想法也應(yīng)運(yùn)而生。

目前，應(yīng)用于MERS-CoV中和抗體檢測(cè)的方法有很多,包括蝕斑減少中和試驗(yàn)[9]、假病毒抑制中和試驗(yàn)[10]、動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)[9]等。在這些試驗(yàn)中，病毒培養(yǎng)，病毒滴度測(cè)定，假病毒包裝，動(dòng)物模型建立等過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且操作復(fù)雜，同時(shí)操作過(guò)程依賴(lài)高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，使得中和抗體的高通量試驗(yàn)及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)難以實(shí)現(xiàn)。本研究擬建立一種不依賴(lài)活病毒，在普通實(shí)驗(yàn)環(huán)境就能實(shí)施的高通量、高效率的MERS-CoV中和抗體檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1主要材料與設(shè)備 Huh-7細(xì)胞，293T細(xì)胞，pFuse-RBD-Fc表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存(RBD為MERS-CoV S蛋白377-588氨基酸序列[11])；DH5α感受態(tài)購(gòu)自北京全式金公司；質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 Reagent購(gòu)自美國(guó)invitrogen; 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 11640，胰酶及青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司；rEDIII-Fc蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存；rRBD-Fc蛋白免疫小鼠的初免血清、RBD人源化單抗hMS-1[12]、 RBD特異性非中和單抗；無(wú)關(guān)抗體Trastuzumab由本實(shí)驗(yàn)室保存；12株具有中和活性的MERS-CoV納米抗體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的MERS-CoV納米抗體噬菌體庫(kù)篩選[13]；32份待測(cè)血清由本實(shí)驗(yàn)室采集保存。細(xì)胞培養(yǎng)器材購(gòu)自美國(guó)康寧公司；蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Red；凝膠成像系統(tǒng)Amersham Imager 600購(gòu)自美國(guó)GE公司；FITC標(biāo)記的抗Fc抗體購(gòu)自北京博奧龍；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；AKTA蛋白純化儀購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.2rRBD-Fc蛋白表達(dá)純化 將293T細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)到175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶70%～90%的面積時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h換液。將129 μL LipofectamineTM3000 Reagent稀釋到4.6 mL的Opti-MEMTM培養(yǎng)液中，輕輕混勻；同時(shí)，將55 μg pFuse-RBD-Fc質(zhì)粒與111 μL P3000TMReagen稀釋到4.6 mL的Opti-MEMTM培養(yǎng)液中，輕輕混勻；將兩份稀釋液等體積混合，室溫孵育10～15 min后，緩慢均勻地滴加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，共轉(zhuǎn)染20瓶。用A蛋白親和層析柱純化細(xì)胞上清，收集目的蛋白溶液。利用SDS-PAGE及抗Fc標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot分析目的蛋白。

1.3rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合效果與蛋白劑量的關(guān)系測(cè)定及結(jié)合特異性驗(yàn)證 將梯度稀釋的50 μL rRBD-Fc蛋白與即時(shí)消化的1×105個(gè)Huh-7細(xì)胞混合，室溫振蕩30 min，37 ℃靜置10 min。將孵育rRBD-Fc蛋白的Huh-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有1 mL 3%FBS的PBS流式管中，洗滌4次。然后將FITC標(biāo)記的抗Fc抗體以1∶1000的稀釋度稀釋?zhuān)抗芗尤?00 μL，錫箔紙包住，室溫震蕩10 min，37 ℃靜置20 min，用1 mL 3%FBS 的PBS洗滌細(xì)胞4次。每管加入250 μL3%FBS 的PBS，輕輕混勻，每管取200 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每管細(xì)胞的熒光值。分別取0.25 μg rRBD-Fc 蛋白和0.25 μg rEDIII-Fc蛋白以相同的實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合Huh-7細(xì)胞，孵育熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.4RBD受體結(jié)合阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中和抗體 將50 μL 4種待測(cè)抗體分別與0.25 μg rRBD-Fc蛋白混合，室溫震蕩30 min，37 ℃靜置10 min, 之后加入到含有5×105個(gè)Huh-7細(xì)胞的流式管中，室溫孵育30 min。用1 mL的3%FBS的PBS洗滌細(xì)胞。之后每管加入100 μL 1:1000稀釋的FITC標(biāo)記的抗Fc抗體，于37 ℃反應(yīng)30 min。用1 mL的3%FBS的PBS洗滌細(xì)胞。用250 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，取200 μL轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)不同濃度抗體對(duì)應(yīng)的平均熒光強(qiáng)度在Graphpad軟件中利用One site - Fit logIC50計(jì)算抗體的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.5中和試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行中和試驗(yàn)，涉及實(shí)毒操作在高等級(jí)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。將2倍倍比稀釋的抗體與100 TCID50的MERS-CoV(EMC/2012株)等體積混合，37 ℃孵育1 h，之后將病毒與抗體混合物接種于96孔板單層Vero E6細(xì)胞，每個(gè)稀釋度4復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)1 h。而后，更換細(xì)胞維持液(含1%FBS、1%雙抗的RPMI-1640)繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect，CPE)，并通過(guò)Reed-Muench法計(jì)算納米抗體50%中和劑量(50% Neutralizing Dose，ND50)。

1.6中和抗體不同檢測(cè)方法一致性分析 運(yùn)用實(shí)毒中和試驗(yàn)和新建立的非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法對(duì)12份中和抗體進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用Graphpad軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1rRBD-Fc蛋白表達(dá)純化 pFuse-RBD-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收集蛋白并純化， 經(jīng)SDS-PAGE和IgG1 Fc標(biāo)簽抗體Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)在51 kD處有單一條帶，表明蛋白表達(dá)正確且純度較高。

A: rRBD-Fc蛋白SDS-PAGE B: rRBD-Fc蛋白Western blot 檢測(cè)圖1 rRBD-Fc蛋白的SDS-PAGE及Western blot結(jié)果圖Fig.1 SDS-PAGE and Western blot of rRBD-Fc protein

2.2rRBD-Fc蛋白功能驗(yàn)證 通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定不同劑量rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合活性，結(jié)果如圖2-A，表明制備的rRBD-Fc蛋白能夠有效結(jié)合Huh-7細(xì)胞，且結(jié)合具有量效關(guān)系。當(dāng)rRBD-Fc為0.25 μg時(shí)，結(jié)合作用達(dá)到平臺(tái)期。因此，以0.25 μg 作為非病毒依賴(lài)中和抗體檢測(cè)方法中rRBD-Fc蛋白使用量。Huh-7細(xì)胞能夠表達(dá)MERS-CoV病毒受體hDPP4，是MERS-CoV病毒易感細(xì)胞系。為驗(yàn)證rRBD-Fc蛋白結(jié)合Huh-7細(xì)胞的特異性，以同樣融合表達(dá)了人IgG1 Fc片段的乙腦病毒E蛋白片段rEDⅢ-Fc作為對(duì)照蛋白和Huh-7作用。結(jié)果如圖2-B，表明對(duì)照蛋白rEDⅢ-Fc不能結(jié)合Huh-7細(xì)胞，而rRBD-Fc蛋白能夠特異性的與Huh-7細(xì)胞結(jié)合。

A: rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合效果與蛋白劑量的關(guān)系測(cè)定B: rRBD-Fc蛋白與Huh-7細(xì)胞特異性結(jié)合的驗(yàn)證圖2 rRBD-Fc蛋白功能驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.2 rRBD-Fc protein functional verification result

2.3RBD受體阻斷實(shí)驗(yàn)中和抗體檢測(cè)方法特異性鑒定 為驗(yàn)證受體阻斷實(shí)驗(yàn)是否只針對(duì)中和抗體而對(duì)其他類(lèi)型的抗體無(wú)識(shí)別作用，選取以rRBD-Fc蛋白作為抗原免疫小鼠得到的具有中和活性的初免血清、針對(duì)抗MERS-CoV中和單抗hMS-1、RBD特異性的非中和單抗以及非RBD特異性的無(wú)關(guān)抗體Trastuzumab來(lái)驗(yàn)證新建立的非實(shí)毒依賴(lài)中和抗體檢測(cè)方法的特異性。結(jié)果表明，RBD特異性的中和單抗hMS-1和rRBD-Fc初免血清均能有效阻斷rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合作用，且已知中和活性弱于中和單抗的rRBD-Fc初免血清在阻斷實(shí)驗(yàn)中同樣表現(xiàn)出了比hMS-1弱的阻斷活性。相比之下，RBD特異性不具有中和活性的抗體樣品和非RBD特異性的無(wú)關(guān)抗體Trastuzumab均對(duì)rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有任何阻斷作用。由此可見(jiàn)，基于rRBD-Fc與Huh-7細(xì)胞結(jié)合活性建立的MERS-CoV RBD特異性中和抗體評(píng)價(jià)方法能夠有效區(qū)分中和抗體和非中和抗體，以及中和抗體活性強(qiáng)弱。

圖3 不同種抗體阻斷rRBD-Fc與Huh-7結(jié)合顯示的熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity of different kinds of antibodies block the rRBD-Fc binding with Huh-7 cell

2.4實(shí)毒中和試驗(yàn)與非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法結(jié)果一致性分析 為驗(yàn)證建立的非實(shí)毒中和抗體檢測(cè)方法與傳統(tǒng)實(shí)毒中和試驗(yàn)的一致性，運(yùn)用這兩種檢測(cè)方法分別檢測(cè)了12份中和抗體樣品。如圖4所示，非實(shí)毒中和抗體檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的實(shí)毒中和試驗(yàn)方法具有很好的一致性。

圖4 ND50與IC50的變化趨勢(shì)散布圖Fig.4 Scatter diagram of variation trend on ND50 and IC50

2.5應(yīng)用非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè) 應(yīng)用建立的非實(shí)毒依賴(lài)的MERS-CoV RBD特異性中和抗體檢測(cè)方法分別檢測(cè)了6份rRBD-Fc免疫小鼠血清、6份正常小鼠血清、10份駱駝血清和10份健康人血清，同時(shí)以實(shí)毒中和試驗(yàn)測(cè)定這些標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。結(jié)果表明，非實(shí)毒依賴(lài)的MERS-CoV RBD特異性中和抗體檢測(cè)方法能夠有效應(yīng)用于血清標(biāo)本的中和抗體篩查。

圖5 非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法高通量檢測(cè)中和抗體Fig.5 Application of non-live-virus neutralization antibody detection method in high flux detection

3 討 論

本研究建立的非實(shí)毒依賴(lài)的MERS-CoV RBD特異性中和抗體檢測(cè)方法是基于RBD特異性的中和抗體可以阻斷RBD與病毒受體DPP4結(jié)合的原理而設(shè)計(jì)的。DPP4是MERS-CoV的功能性受體，而Huh-7細(xì)胞是MERS-CoV敏感細(xì)胞系，能夠表達(dá)DPP4受體蛋白，且能與rRBD-Fc特異性結(jié)合。位于S1亞基的RBD是與DPP4結(jié)合的功能單位，融合表達(dá)帶有人IgG Fc標(biāo)簽的RBD蛋白，可構(gòu)成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的重組蛋白[14]。在此基礎(chǔ)上，rRBD-Fc能夠特異性得結(jié)合Huh-7細(xì)胞，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗Fc抗體又能特異性的與rRBD-Fc結(jié)合，在細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)，可以收集到細(xì)胞攜帶的綠色熒光信號(hào)；中和抗體可以阻斷RBD與DPP4的結(jié)合，孵育中和抗體的rRBD-Fc蛋白不再具有結(jié)合Huh-7細(xì)胞的功能，因此FITC標(biāo)記的抗Fc抗體被洗脫，流式細(xì)胞儀不能檢測(cè)到熒光信號(hào)。而不具有中和活性的抗體，包括非RBD特異性抗體和RBD特異性非中和抗體，都不能夠阻斷RBD與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合，這樣在孵育FITC標(biāo)記的抗Fc抗體后依然可以檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)。因此，熒光強(qiáng)度越弱，中和抗體的阻斷效果越好，中和活性越高。

本研究建立的非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法具有RBD特異性。本方法在篩選非RBD特異性中和單抗時(shí)尚存在一定的局限性，但RBD與病毒受體的結(jié)合是MERS-CoV感染的第一步，RBD功能區(qū)是介導(dǎo)病毒感染和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵功能區(qū)，因此，在MERS-CoV感染血清中必然存在大量RBD特異性的中和抗體。而且，目前包括鼠源單抗[15]、人源化單抗[12]、及人源單抗[16]在內(nèi)的一系列已經(jīng)報(bào)道的治療性候選單抗都是針對(duì)RBD功能區(qū)的。因此，本研究建立的RBD特異性中和抗體檢測(cè)方法在篩選中和單抗時(shí)同樣具有實(shí)用價(jià)值。除此之外，在臨床上，感染MERS-CoV的患者，按照臨床癥狀嚴(yán)重程度不同可以分為無(wú)癥狀、有癥狀無(wú)肺炎、有肺炎無(wú)呼吸困難、肺炎轉(zhuǎn)化為呼吸衰竭4種類(lèi)型，患者血清轉(zhuǎn)歸方向決定了愈后。通過(guò)中和試驗(yàn)檢測(cè)患者血清中和抗體，若21 d后，機(jī)體還未產(chǎn)生中和抗體，即發(fā)生血清陽(yáng)性轉(zhuǎn)歸，患者接連死亡；而21 d內(nèi)機(jī)體能夠產(chǎn)生中和抗體的患者，則全部存活[17]。因此，中和抗體是病人產(chǎn)生良性愈后的必要條件，而快速、高效得檢測(cè)中和抗體效價(jià)，是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者病程轉(zhuǎn)歸，評(píng)價(jià)治療方法的必要手段。

本研究建立的非實(shí)毒依賴(lài)的MERS-CoV RBD特異性中和抗體檢測(cè)方法在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅需用到重組蛋白、細(xì)胞、相關(guān)標(biāo)記抗體以及流式細(xì)胞儀，在普通的實(shí)驗(yàn)環(huán)境即可完成，非常安全便捷。而傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)需要在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行MERS-CoV實(shí)毒操作，不僅整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，并且安全風(fēng)險(xiǎn)高；通過(guò)假病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體雖然可以不依賴(lài)高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，但仍需要病毒包裝，病毒滴度測(cè)定等一系列過(guò)程，同樣耗時(shí)耗力[10]。本研究建立的這種非實(shí)毒依賴(lài)的中和抗體檢測(cè)方法可在一天內(nèi)完成，且十分安全，檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)典中和試驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果一致，穩(wěn)定性好，不需鏡下觀察，容易質(zhì)控，結(jié)合高通量流式檢測(cè)手段，將是血清學(xué)篩查、中和抗體篩選、臨床標(biāo)本檢測(cè)的理想選擇，不論在臨床還是科研中都有廣泛的應(yīng)用前景。

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