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鼠形動物是一類種類多，數(shù)目龐大的小型哺乳類動物，其繁殖能力強，生活環(huán)境多樣，并且對自然環(huán)境有著極強的適應性，是多種病原體的儲存宿主。巴爾通體是一種通過媒介傳播的革蘭陰性菌，近年來，隨著人獸共患病的增多，巴爾通體在鼠形動物中的攜帶情況引起了國內外研究者的關注。目前在全球范圍內，嚙齒類動物具有較高的巴爾通體感染率，并且已有30余種巴爾通體被成功分型[1]。人可通過節(jié)肢動物的叮咬引起菌血癥或與鼠形動物密切接觸而感染巴爾通體，主要引起貓抓病、戰(zhàn)壕熱、心內膜炎及菌血癥等典型和常見疾?。淮送?，一些癥狀不典型的發(fā)熱病例也證實為巴爾通體感染[2]。

廣東省地處我國大陸南端，貿易發(fā)達，是人口活動最頻繁，最開放的省份之一，其豐富的雨水環(huán)境和亞熱帶季風氣候為自然疫源性疾病宿主動物提供了優(yōu)質的生存條件。目前我國許多地區(qū)已開展鼠形動物攜帶巴爾通體的調查研究，但關于廣東省巴爾通體的分布情況和病原特征還未見報道，人群中巴爾通體引起的疾病資料也有限。本研究旨在通過對廣東地區(qū)巴爾通體病原體的研究，了解該地區(qū)鼠形動物攜帶巴爾通體的情況及其生物多樣性特征，為疾病的預防和控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本采集 研究分別選擇地處廣東省中部、西部和東部的惠州市惠東縣，茂名市高州市，云浮市羅定縣，潮州市潮安縣，揭陽市惠來縣共5個地區(qū)作為監(jiān)測點，采樣區(qū)分布見圖1。鼠形動物的捕捉主要以籠夜法進行：即居民區(qū)每戶放置5個籠，連續(xù)布放3 d，100籠次/d；野外每5 m放置1個籠，連續(xù)布放3 d；100籠次/d，晚放晨收。捕獲的動物帶回實驗室后進行種類鑒定，記錄每只鼠形動物的背景資料，包括編號、釆集時間、地點、鼠種、雌雄等。麻醉后無菌采集血清、肝、脾、肺、腎等臟器組織材料，標本冷藏保存并帶回至廣東省疾病預防控制中心。

1.2 試劑與設備

1.2.1分子生物學檢測 肝組織材料核酸提取試劑盒(Qiagen cador pathogen kit), real time PCR試劑盒(QuantiTect Probe PCR Kit)，2000 bp DNA marker(Takara)，菌落DNA提取試劑盒(Bio-Rad InstaGene Matrix)；引物，探針由英濰捷基貿易有限公司廣州合成部合成。

1.2.2組織分離培養(yǎng) 胰酶大豆肉湯，5%羊血胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景微生物科技有限公司)，磁珠菌株保存液，含30%甘油的腦心浸液。

1.2.3儀器設備 組織研磨儀(Precellys 24 均質器)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96型)，CO2培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1巴爾通體的分子生物學檢測 稱取約25 mg的肝臟組織，加入PBS，運用均質研磨器充分研磨臟器后按照試劑盒說明提取總核酸。熒光定量PCR反應體系25 μL，模板DNA加5 μL，2Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，探針0.5 μL，加去離子水定容至25 μL，反應用文獻[2]中所用引物，上游引物：5′-GCTATGGTAATAAATGGACAATGAAATAA-3′；下游引物：5′-GCTTCTGTTGCCAGGTG-3′；探針：FAM-ACCCCGCTTAAACCTGCGACG-BHQ1；反應條件為94 ℃預變性，30個循環(huán)：94 ℃ 30 s，60 ℃退火40 s，收集熒光信號。每次實驗為防止假陽性，樣本處理，反應體系的制備，PCR擴增均在不同區(qū)域進行，并設定陽性對照和空白對照。

1.3.2分離培養(yǎng) 將經熒光定量PCR鑒定為陽性的樣本進行分離培養(yǎng)，每份肝組織樣本取約25 mg，加入約400 μL的胰酶大豆肉湯研成勻漿，然后吸取約100 μL接種于含5%羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基上，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，觀察生長情況，最長觀察時間25 d，并進行菌落分純，對疑似菌落進行PCR鑒定，最后收集陽性純菌保存。

1.3.3序列測定與分析 熒光定量PCR擴增非編碼RNA(ssrA)基因，經研究證明與gltA基因具有相同的遺傳學分類功能[3]， PCR產物送至廣州艾基生物有限公司進行測序，在NCBI上將序列與參考序列進行搜索比對，運用MegAlign軟件進行同源性分析，并用Mega6.0，采用鄰接法，bootstrap 1000構建系統(tǒng)發(fā)育樹；采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，率的比較采用卡方檢驗和Fisher’s概率確切法，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1各地區(qū)鼠形動物的分布 2016-2017年，于廣東省惠來縣、惠東縣、潮安縣、羅定縣和高州市5個地區(qū)共捕獲鼠形動物375只，隸屬2目3科6屬8種。5個地區(qū)樣本量分別為惠東縣143份，高州市26份，潮安縣81份，羅定縣46份，惠來縣79份；其中以褐家鼠(R.norvegicus)和黃胸鼠(R.flavipectus)數(shù)量占優(yōu)勢，分別為239只和53只。其余捕獲的鼠形動物中，有屋頂鼠(R.rattus)9只，臭鼩鼱(Suncusmurinus)32只，黃毛鼠(R.losea)19只，田鼠(Microtinae)2只，板齒鼠(Bandicotaindica)17只，卡式小鼠(Muscaroli)4只。各地的鼠種構成中基本均以褐家鼠為優(yōu)勢鼠種，云浮羅定市主要以板齒鼠居多。見表1。

表1 廣東省鼠形動物分布和巴爾通體感染情況
Tab.1 Distribution and Bartonella prevalence of rodents in Guangdong Province

鼠種陽性數(shù)/樣本數(shù)(%)合計惠東縣高州市潮安縣羅定縣惠來縣褐家鼠49/239(20．50)28/137(20．44)6/20(30．00)9/39(23．08)0/16/42(14．28)黃胸鼠10/53(18．87)1/6(16．67)0/2(0)5/22(22．73)4/10(40．00)0/13(0)屋頂鼠2/9(22．22)0/0/01/1(100．00)0/0/(0)1/8(12．5)0/0(0)臭鼩鼱4/32(12．50)0/0(0)2/2(100．00)0/16(0)1/1(100．00)1/13(7．69)黃毛鼠7/19(36．84)0/0(0)0/1(0)1/1(100．00)4/6(66．67)2/11(18．18)田鼠0/2(0)0/0(0)0/0(0)0/2(0)0/0(0)0/0(0)板齒鼠1/17(5．88)0/0(0)0/0(0)0/1(0)1/16(6．25)0/0(0)卡氏小鼠0/4(0)0/0(0)0/0(0)0/0(0)0/4(0)0/0(0)合計73/375(19．47)29/143(20．27)9/26(34．62)15/81(18．52)11/46(23．91)9/79(11．39)

2.2巴爾通體檢測結果 用具有巴爾通體種屬水平特異性的ssrA基因引物[3]進行熒光定量PCR基因檢測，獲得73份陽性樣本。經測序確認，該73份均為巴爾通體序列，總陽性率為19.47%。感染鼠種為褐家鼠、黃胸鼠、屋頂鼠、臭鼩鼱、黃毛鼠、板齒鼠，其中以黃毛鼠陽性率最高36.84%，田鼠和卡式小鼠陽性率為0%，但樣本量太少，缺乏代表性；不同鼠形動物間巴爾通體陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.361，P=0.254)。5個地區(qū)巴爾通體檢測陽性率最高的為茂名市高州市34.62%，其次為云浮市羅定縣23.91%，但各地區(qū)陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=7.778，P=0.100)。見表1。不同性別鼠形動物間巴爾通體陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.292，P=0.589)。不同生活環(huán)境之間陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.621，P=0.431)。見表2。

2.3巴爾通體分離培養(yǎng)結果 對73份PCR陽性肝組織樣本進行巴爾通體分離培養(yǎng)，共有10份樣本有明顯的菌落生長。接種后每天觀察1次，一般接種5～6 d后開始長出菌落，可觀察到呈灰白色，略透明，邊緣光滑或粗糙的圓形凸起菌落。有時平板可有較多雜菌生長，挑取單個菌落進行克隆，可于最多一周后長出菌落，大小較大于原代，有些呈現(xiàn)菜花樣，經接種環(huán)刮起后可見圓形小凹陷，與文獻中描述形態(tài)相符[4]。對菌落進行PCR鑒定后確定為巴爾通體，見圖2。

表2 不同性別、棲息環(huán)境間巴爾通體陽性率的比較
Tab.2 Comparison of the positive rate of Bartonella infection in different gender and habitats

因素例數(shù)陽性數(shù)陽性率(%)雌性1753218．28雄性2004120．50χ2=0．292P=0．589居民區(qū)—庭院3016120．26農田、竹林、灌叢741216．22χ2=0．621χ2=0．431

圖2 5%羊血TSA培養(yǎng)基上巴爾通體菌落(分離自肝)Fig.2 Culture result of Bartonella isolates(isolated from liver)

圖3 基于巴爾通體ssrA基因片段的系統(tǒng)發(fā)育關系Fig.3 Phylogenetic relationships of B. isolates constructed based on Neighbor-Joining for ssrA gene

2.4基因特征分析 對擴增產物進行測序，獲得69份有效序列，GenBank序列號為MF765614-MF765682，并基于GenBank中ssrA基因的參考序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示共存在6種基因型的巴爾通體，均處于L1(鼠相關巴爾通體)的大分支中；而L2中的巴爾通體主要分離自反芻類動物，L3分支則代表了2014年從泰國分離的新的巴爾通體。每個地區(qū)菌株基因型均至少存在3種，其中潮安縣存在5種基因型的巴爾通體。從褐家鼠和黃胸鼠分離的菌株基因型多樣；而臭鼩鼱和板齒鼠分離的主要為B.elizabethae。以GDHD66為代表的巴爾通體與來自泰國的B.tribocorumKT355808處于同一分支，同源性達到98.8%～100%；以GDGZ21為代表的樣本與美國的B.elizabethaeJN029774分為一支；分離自惠來縣褐家鼠的GDHL62與B.phoceensisJN029770相聚集；以GDLD09為代表的與日本的B.japonicaJN029784最為親近；以GDCA08為代表的與分離自美國褐家鼠的B.henselaeHouston JN029785處同一分支；其余的巴爾通體與秘魯?shù)腂.rochalimaeFN645497同源性最高。見圖3。

3 討 論

我國自1999年白瑛[5]等于云南地區(qū)鼠形動物中成功分離到B.elizabethae后，越來越多的研究者開始關注這一病原體。從2002-2017年，幾乎每年我國均有從不同宿主分離巴爾通體的文獻報道，覆蓋區(qū)域包括云南、山東、北京、河南、福建、浙江、黑龍江、青海、上海、內蒙古、寧夏、山西、廣西、臺灣等多個地區(qū)[4, 6-10]，各地區(qū)從鼠形動物中檢出巴爾通體的陽性率為2.3%～57.26%。其中，我國北部和西南部的陽性率較高，最高可達57.6%[7]。目前還沒有人對廣東省鼠形動物感染巴爾通體的情況展開調查，而通過本次研究，獲得鼠形動物感染巴爾通體的陽性率為19.47%，相比海南和廣西的研究數(shù)據(jù)較高，進一步證實了華南地區(qū)鼠形動物中存在巴爾通體感染，填補了廣東省對該病原體的研究空白。

目前，已知能檢測到巴爾通體的鼠種至少包括褐家鼠，黃胸鼠、黃毛鼠、小家鼠、屋頂鼠、田鼠、大絨鼠、斑胸鼠、大足鼠等以及食蟲目動物臭鼩鼱，本研究是我國首次從板齒鼠中檢測到巴爾通體。同時，國內外有研究報道證實可從貓、狗、反芻動物，甚至獼猴類動物中檢測[11-14]到巴爾通體，提示巴爾通體對哺乳類動物可能有著較強的適應性，而這種廣泛的宿主適應性是否對動物和人類健康有著潛在的威脅，值得進一步研究探索。

目前，巴爾通體感染最為高效便捷的手段就是進行PCR檢測。SsrA(tmRNA)是存在于細菌中一類穩(wěn)定的小RNA，同時具備信使RNA和轉錄RNA的功能。本研究運用文獻中[3]ssrA基因引物進行熒光定量檢測，該基因與傳統(tǒng)的gltA片段具有相同的種屬鑒定功能，說明在大量樣本的鑒定中，通過擴增ssrA片段并進行序列比對，可作為一種分類巴爾通體的快速準確的方法。

此次研究中，共檢測到6種基因型的巴爾通體，分別為B.elizabethae、B.phoceensis、B.japonica、B.henselae、B.rochalimae、B.tribocorum，表明廣東省鼠形動物中巴爾通體基因型具有多樣性和復雜性。其中B.elizabethae,B.henselae,B.rochalimae,B.tribocorum都已證實與人類疾病有關，可引起貓抓病、桿菌性血管瘤、菌血癥、心內膜炎、發(fā)熱等[15]。人群中巴爾通體感染的血清學調查研究顯示，人巴爾通體抗體的血清陽性率大多在3.6%～11.0%之間，而不明原因發(fā)熱的病人中血清抗體陽性率可達到30.17%[2]。人群中大多因貓抓病引起淋巴結腫大發(fā)現(xiàn)感染，而結合這些血清學的調查表明，除了貓抓病，其他癥狀的巴爾通體感染誤診和隱性感染不容忽視。

鼠形動物可攜帶多種病原體，同時也是節(jié)肢動物的宿主，不同病原體的共生及媒介的傳播對疾病的發(fā)生起著重要作用。人類和鼠形動物之間直接和間接接觸密切，因此做好鼠傳疾病的防控工作顯得尤為重要。本研究首次證實廣東省內鼠形動物存在巴爾通體感染，且板齒鼠也是巴爾通體的易感動物，這為廣東省內人獸共患病防控工作提供了新的依據(jù)和研究方向。由于巴爾通體對人類潛在的危險性，有必要進一步對巴爾通體在人群中的流行情況和傳播途徑進行探索研究。

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