王 強(qiáng),王 鍇，黃梅桂,謝躍杰,鄧朝芳,王仲明,熊政委,王 波

(1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶 400067;2.重慶第二師范學(xué)院脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067;3.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院,江蘇南京 210037;4.甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心,甘肅蘭州 730020)

橄欖油是指以油橄欖鮮果為原料制取的油脂(不包含溶劑浸提或重酯化過程獲得的油脂),并且不得摻雜其他種類的油脂[1-3]。我國GB 23347-2009《橄欖油、油橄欖果渣油》中規(guī)定橄欖油分三類:初榨橄欖油(virgin olive oil,VOO),精煉橄欖油(refined olive oil,ROO)和混合橄欖油(blended olive oil)[4];其中,初榨橄欖油具有最高的品質(zhì)和營養(yǎng)價值。但是,部分商人受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使,目前最普遍的橄欖油摻偽方式是VOO中摻入ROO,而對于橄欖油摻偽的鑒別,主要基于脂肪酸組成的傳統(tǒng)分析方法日益受到挑戰(zhàn),近年來更多的研究則基于橄欖油中微量標(biāo)記物的檢測[1,5-8]。

羥基酪醇(Hydroxytyrosol)和酪醇(Tyrosol)均為苯乙醇類的衍生物,是植物體內(nèi)復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物[9-10]。相關(guān)研究表明,羥基酪醇和酪醇不僅具有抗癌、抗菌、抗病毒等功能,還能夠預(yù)防腫瘤,保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害等多種生物活性[11-13]。隨著初榨橄欖油貨架期的增加,酪醇和羥基酪醇的含量遞減;而精煉橄欖油中含有極少量或不含有羥基酪醇和酪醇,鑒于此,羥基酪醇和酪醇可作為評價橄欖油品質(zhì)的及真?zhèn)舞b別的重要指標(biāo)之一[1,6]。

近年對羥基酪醇和酪醇生物功能活性及其制備工藝方面的報道較多[14-17],對于其含量的檢測鮮有報道?，F(xiàn)有報道的檢測方法多為高效液相色譜法[18-19],液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[20],氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21]等,對于色譜質(zhì)譜法,因為儀器的價格昂貴,在國內(nèi)還未被普遍使用;高效液相色譜方法,較多的僅使用紫外檢測器對其進(jìn)行檢測,特異性不強(qiáng),樣品中的雜質(zhì)對目標(biāo)物的干擾較大,定量不準(zhǔn)確,分析時間長,不能用于橄欖油中微量羥基酪醇及酪醇的同時測定。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)熒光檢測器同時測定橄欖油中微量羥基酪醇及酪醇的含量,并在10 min內(nèi)實現(xiàn)了目標(biāo)物的分離。實驗表明,本方法靈敏度高、重復(fù)性好,為橄欖油中羥基酪醇和酪醇的定性與定量檢測提供了一種高效可行的色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羥基酪醇、酪醇 純度≥98%，美國SIGMA公司;甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷 德國Merck公司;其余試劑 均為分析純。

超高效液相色譜儀 美國Waters公司,配有Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及熒光檢測器;3K30冷凍離心機(jī) 美國SIGMA公司;MS3渦旋儀 德國IKA公司;100～1000 μL、1.0～5.0 mL移液槍 美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高效液相色譜條件 色譜柱為UPLC BEH C18(50 mm×1.0 mm,1.7 μm);流動相:A為0.2%(v/v)甲酸乙腈,B為0.2%(v/v)甲酸水;流速0.15 mL/min;進(jìn)樣量:2.0 μL;柱溫35 ℃;激發(fā)波長為300 nm,發(fā)射波長為350 nm;梯度洗脫:流動相A,初始5%,0.0～5.0 min流動相A比例由5%變?yōu)?%,5.0～8.0 min流動相A由8%變?yōu)?0%,8.0～9.0 min流動相A比例回到5%,平衡2.0 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱取羥基酪醇和酪醇適量,用0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液溶解并定容至100 mL,配制成分別含羥基酪醇和酪醇為106和132 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃下冷藏待用。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取橄欖油樣品1.00 g于15 mL離心管中,加入無水乙醇2.0 mL,渦旋1.0 min,超聲提取1.0 min后,置于冷凍離心機(jī)中,待離心機(jī)溫度穩(wěn)定于4.0 ℃時,14000 r/min冷凍離心10 min,取上層溶液1.0 mL,氮氣吹近干,再用0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液定容至1.0 mL,0.22 μm微孔濾膜過濾后經(jīng)超高效液相色譜分析,外標(biāo)法定量。

1.2.4 提取條件的優(yōu)化

1.2.4.1 提取溶劑的選擇 取同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)4份各1.00 g,置于15 mL離心管中,分別加入正己烷、乙腈、甲醇和乙醇溶液各2.0 mL;其余步驟及提取條件均按照“1.2.3 樣品處理”操作;樣品進(jìn)樣后以羥基酪醇和酪醇的提取率為指標(biāo),分別按確定的色譜條件進(jìn)樣檢測。

1.2.4.2 定容溶劑的選擇 取同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)2份各1.00 g,置于15 mL離心管中,按照“1.2.3 樣品處理”步驟及提取條件操作;樣品定容時分別使用乙腈和0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液定容至1.0 mL,按確定的色譜條件進(jìn)樣檢測。

1.2.4.3 提取方式的選擇 取同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)4份各1.00 g,置于15 mL離心管中,分別通過四種提取方式(直接提取、渦旋提取、超聲提取以及渦旋和超聲提取)分別對橄欖油樣品進(jìn)行提取,其余步驟及提取條件均按照“1.2.3樣品處理”操作;樣品進(jìn)樣后以羥基酪醇和酪醇的提取率為指標(biāo),按確定的色譜條件進(jìn)樣檢測。

1.2.4.4 離心溫度的選擇 取同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)3份各1.00 g,置于15 mL離心管中,按照“1.2.3 樣品處理”步驟及提取條件操作,離心時分別在4、10 ℃及室溫(25 ℃)下對樣品進(jìn)行離心,然后觀察橄欖油樣品的乳化程度,確定最佳離心溫度。

1.2.5 流動相的選擇 乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-甲酸系統(tǒng)都是在C18柱中應(yīng)用最為廣泛的流動相,其中流動相pH的高低直接影響到羥基酪醇和酪醇的分子狀態(tài)及在色譜柱上的分離效果。鑒于此,取同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)1.00 g,置于15 mL離心管中,按照“1.2.3 樣品處理”步驟及提取條件操作,樣品分析時,分別以乙腈和0.2%(v/v)甲酸乙腈為流動相,通過羥基酪醇和酪醇的保留時間、峰形以及樣品中與雜質(zhì)的分離效果為指標(biāo),確定最佳流動相。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由表1可以看出,當(dāng)使用正己烷作為提取溶劑時,橄欖油完全溶解于正己烷中,

表1 不同提取溶劑對羥基酪醇和酪醇回收率的影響Table 1 Effects of different extraction solvents on the recovery of hydroxytyrosol and tyrosol

羥基酪醇和酪醇的提取率均達(dá)到98.39%以上;當(dāng)使用甲醇、乙腈或乙醇作為樣品提取溶劑時,乙醇對羥基酪醇和酪醇的提取率優(yōu)于乙腈或甲醇;但是樣品進(jìn)樣后,因為正己烷和流動相極性的不兼容導(dǎo)致羥基酪醇和酪醇的色譜峰形變形,保留時間改變,見圖1;因此,選擇乙醇作為最佳的提取溶劑。

圖1 提取溶劑為正己烷時的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of extracting solvent as n-hexane

2.2 定容溶劑的選擇

當(dāng)使用乙腈溶液作為定容溶劑時,橄欖油樣品經(jīng)色譜分析發(fā)現(xiàn)酪醇和羥基酪醇拖尾較為嚴(yán)重,見圖2;使用0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液作為定容溶劑時,峰形尖銳,拖尾現(xiàn)象得到明顯的改善;因此,選擇0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液作為定容溶劑。

圖2 溶劑為乙腈時的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of solvent as acetonitrile

2.3 提取方式的選擇

當(dāng)橄欖油樣品不進(jìn)行渦旋和超聲提取時,酪醇和羥基酪醇的提取率較低;僅使用渦旋或超聲提取方式時,回收率有明顯的提高;當(dāng)同時使用渦旋和超聲兩種提取方式時,羥基酪醇和酪醇的提取率可達(dá)到最大,見表2;需要注意的是,當(dāng)渦旋時間和超聲時間超過1.0 min后,提取溶液乳化現(xiàn)象嚴(yán)重,鑒于此,確定實驗中提取方式為渦旋和超聲提取,且渦旋和超聲提取時間分別為1.0 min。

表2 不同提取方式對羥基酪醇和酪醇回收率的影響Table 2 Effects of different extraction methods on the recovery of hydroxytyrosol and tyrosol

2.4 離心溫度的選擇

離心時樣品的溫度直接影響到樣品和提取溶液的分層,當(dāng)離心時的溫度為10.0 ℃和常溫(25 ℃)時,樣品仍有較大的乳化現(xiàn)象,分層不明顯;當(dāng)離心時的溫度為4.0 ℃時提取效果最好,溶液分層明顯,乳化現(xiàn)象較小。故確定實驗中離心時的溫度選擇為4.0 ℃。

2.5 流動相的優(yōu)化

由于在樣品的分離分析過程中,流動相的合適與否直接影響著目標(biāo)物的峰形、靈敏度及分離度。當(dāng)選用乙腈為流動相時,酪醇和羥基酪醇的保留較弱;此外,在橄欖油樣品分析過程中,因為羥基酪醇較弱的保留使得與樣品中某一雜質(zhì)重合,無法對其準(zhǔn)確定量,見圖3;而選用0.2%(v/v)甲酸乙腈做流動相時,酪醇和羥基酪醇的色譜峰形尖銳,并且無拖尾現(xiàn)象,保留時間增加,在樣品分析過程中,橄欖油樣品中的某一雜質(zhì)與羥基酪醇完全分離;因此,本實驗選用0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液做為流動相。

圖3 流動相為乙腈時的標(biāo)準(zhǔn)及樣品色譜圖Fig.3 Standard and sample chromatogram of mobile phase as acetonitrile

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 穩(wěn)定性實驗 取C1號橄欖油樣品,按照“1.2.3”處理樣品,按照“1.2.1”所述色譜條件,在室溫條件下,分別經(jīng)0、4、12、24、48 h進(jìn)樣分析可知,橄欖油樣品中羥基酪醇和酪醇在4 h后開始降解,在24 h內(nèi)降解超過35%,見圖4,故在樣品處理完成后需在12 h內(nèi)進(jìn)行分析。

圖4 不同時間羥基酪醇和酪醇的降解曲線Fig.4 The degradation curve of the hydroxytyrosol and tyrosol at different times

2.6.2 專屬性實驗 取所得樣品溶液(樣品編號:C1)、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性供試品溶液,按“1.2.1”所述的色譜條件進(jìn)樣分析,將陰性樣品、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的色譜圖進(jìn)行比較,陰性樣品在羥基酪醇和酪醇出峰位置無干擾,表明該方法測定方法專屬性好。

2.6.3 線性范圍及定量限 分別精密量取羥基酪醇和酪醇的對照品溶液0.10、0.50、1.00、5.00、10.00和50.00 mL,置于100 mL棕色容量瓶中,用0.2%(v/v)甲酸乙腈溶液定容至刻度,得到質(zhì)量濃度范圍在0.13～66.0 μg/g的系列溶液。按照“1.2.1”所述色譜條件,每個濃度依次進(jìn)樣2.0 μL,以濃度(μg/g)為橫坐標(biāo),以峰面積(A)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表3,由表3可見,酪醇和羥基酪醇在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 羥基酪醇和酪醇線性范圍及定量限Table 3 Linear range and quantitative limits of hydroxytyrosol and tyrosol

2.6.4 精密度實驗 分別對儀器精密度進(jìn)行考察;按照“1.2.1”所述色譜條件,對羥基酪醇和酪醇標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次,日內(nèi)精密度的RSD范圍在0.57%～0.83%之間;日間精密度是經(jīng)連續(xù)三天的重復(fù)進(jìn)樣,其RSD范圍在0.72%～0.93%之間,可以看出所使用的分析儀器具有較好的日間和日內(nèi)精密度,能夠滿足羥基酪醇和酪醇的檢測要求。

2.6.5 重復(fù)性實驗 準(zhǔn)確稱取同一橄欖油樣品6份(樣品編號:C1),按照“1.2.3”進(jìn)行樣品處理,“1.2.1”所述色譜條件進(jìn)樣分析,通過計算羥基酪醇和酪醇的含量及RSD,見表4,由表4可以看出,6份同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)中羥基酪醇和酪醇含量的RSD分別為2.58%和4.73%。表明方法重復(fù)性較好。

表4 橄欖油樣品中羥基酪醇和酪醇化合物的含量Table 4 The contents of hydroxytyrosol and tyrosol in olive oil samples

2.6.6 加標(biāo)回收率實驗 準(zhǔn)確稱取6份同一橄欖油樣品(樣品編號:C1)1.00 g,每2份樣品為一組,每組分別準(zhǔn)確加入高、中、低三種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.2.3”進(jìn)行樣品處理,按“1.2.1”所述的色譜條件進(jìn)樣分析,由結(jié)果可知,羥基酪醇和酪醇的加標(biāo)回收率范圍分別在94.14%～102.17%之間,結(jié)果見表5,結(jié)果表明本實驗方法回收率較好,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表5 橄欖油樣品中羥基酪醇和酪醇的回收率Table 5 The recovery of hydroxytyrosol and tyrosol in olive oil samples

2.7 實際樣品的測定

取所收集的20批次橄欖油樣品,準(zhǔn)確稱取1.00 g,按“1.2.3”進(jìn)行樣品處理,按“1.2.1”所述的色譜條件進(jìn)樣分析,重復(fù)3次,計算羥基酪醇和酪醇的含量,結(jié)果見表6;羥基酪醇和酪醇標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖及部分橄欖油樣品色譜圖見圖5～圖8。

表6 20批橄欖油樣品中羥基酪醇和酪醇的含量Table 6 Contents of hydroxytyrosol and tyrosol in 20 batches of olive oil samples

圖5 羥基酪醇和酪醇標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.5 Chromatography of the hydroxytyrosol and tyrosol standards

圖6 橄欖油樣品(樣品編號:C1)色譜圖Fig.6 Chromatography of the olive sample(No:C1)

圖7 橄欖油樣品(樣品編號:M4)色譜圖Fig.7 The chromatography of the olive sample(No:M4)

圖8 橄欖油樣品(樣品編號:R2)色譜圖Fig.8 The chromatography of the olive sample(No:R2)

由表6可以看出,經(jīng)橄欖油企業(yè)直接抽取的樣品,羥基酪醇和酪醇的含量均較高,羥基酪醇含量范圍在20.34～12.47 μg/g,酪醇含量范圍在21.22～6.72 μg/g;而經(jīng)超市購買的橄欖油樣品,經(jīng)分離分析,羥基酪醇和酪醇的含量范圍較大,有部分樣品(M3和M6)甚至并未檢測出目標(biāo)物,其原因可能是因為橄欖油樣品在超市的儲存條件不佳以及貨架期不同所導(dǎo)致的;實驗室自制精煉油,并未檢出羥基酪醇和酪醇,由此可以推斷橄欖油中羥基酪醇和酪醇的含量反映了橄欖油自身的品質(zhì)及質(zhì)量,這為橄欖油的摻偽鑒別提供了一定的思路。本實驗所建立的最佳色譜分析方法對20批不同來源的橄欖油中羥基酪醇和酪醇的含量進(jìn)行測定,結(jié)果含量差異較大,這可能是由于橄欖果的品種、產(chǎn)地、種植方式、氣候和橄欖油的生產(chǎn)工藝等因素導(dǎo)致。

3 結(jié)論

本實驗采用超高效液相色譜法同時測定了橄欖油中的微量羥基酪醇和酪醇。通過方法學(xué)考察,該方法靈敏度高,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好,完成一次分析僅10 min;熒光檢測器的特異性使得樣品中雜質(zhì)對目標(biāo)物的干擾程度大大降低,羥基酪醇和酪醇含量的檢測更加準(zhǔn)確,可用于橄欖油中微量羥基酪醇和酪醇含量的高通量測定,該方法將為橄欖油的摻偽及質(zhì)量控制提供參考和技術(shù)支持。

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