李建平，張 鐵，曾文波*

（1.文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院文山州生物資源開(kāi)發(fā)研究中心，云南 文山 663099）

蟲(chóng)草類真菌Cordyceps s.l.感染寄主后形成蟲(chóng)菌復(fù)合體，包括大多數(shù)蟲(chóng)草、菌菌復(fù)合體（如大團(tuán)囊蟲(chóng)草、頭狀蟲(chóng)草和分枝蟲(chóng)草等）[1]，以及重寄生（多頭霉等可寄生于其他蟲(chóng)草菌上）[2]，蟲(chóng)草類真菌形態(tài)獨(dú)特，昆蟲(chóng)等被真菌感染后僵死，真菌利用寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)長(zhǎng)成子座或孢梗束突出于寄主表面，完整的子實(shí)體包括蟲(chóng)體部分（菌核）和一段似草的部分子座（或孢梗束），因此人們形象地將之稱為蟲(chóng)草。

“蟬花”（Isaria cicadae）是我國(guó)名貴傳統(tǒng)中藥材，最早關(guān)于“蟬花”的記載是成書(shū)于公元五世紀(jì)的《雷公炮炙論》[3]，現(xiàn)代研究表明，蟬花為真菌Isaria cicadae Miquel感染蟬若蟲(chóng)后形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體[4]，分布廣泛，包括中國(guó)、韓國(guó)、日本、澳大利亞、新西蘭、巴西、南亞、歐洲、北美等國(guó)家和地區(qū)[4－5]，具有多種藥理作用，在我國(guó)的藥用歷史超過(guò)1 500年，可作為冬蟲(chóng)夏草的代用品[3－4]，蟬花是具有巨大開(kāi)發(fā)價(jià)值的野生資源之一。

目前，關(guān)于蟲(chóng)草類真菌的形態(tài)特征研究多是關(guān)于蟲(chóng)草子座、菌核、子囊結(jié)構(gòu)[6-12]，以及菌絲體形態(tài)[4]的描述，關(guān)于蟲(chóng)草居群形態(tài)學(xué)的報(bào)道很少，本文以居群為單位，研究蟬花的孢梗束、菌核形態(tài)在居群間和居群內(nèi)及個(gè)體間形態(tài)變異式樣。從形態(tài)角度探討蟬花狀變異式樣與生態(tài)適應(yīng)特征，揭示其分化特點(diǎn)，為蟬花資源的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和測(cè)定方法

1.1 材料

用于觀察的材料為新鮮蟲(chóng)草，包括蟬花10個(gè)居群共100個(gè)個(gè)體，冬蟲(chóng)夏草（Ophiocordyceps sinensis）5個(gè)居群共50個(gè)個(gè)體，詳見(jiàn)表1。

表1 10個(gè)居群蟬花和5個(gè)居群冬蟲(chóng)夏草來(lái)源Tab.1 Locality of 10 populations of Isaria cicadae and 5 populations of Ophiocordyceps sinensis

1.2 形態(tài)性狀測(cè)定方法

采用生物統(tǒng)計(jì)方法[13]，每個(gè)居群隨機(jī)選取新鮮樣品10個(gè)個(gè)體，按蟲(chóng)草不同部位（菌核部分，孢梗束或子座部分），分別測(cè)量其重量、周長(zhǎng)、長(zhǎng)、分枝數(shù)等性狀，其中，重量為樣品干燥后測(cè)定值，每個(gè)性狀測(cè)量3次，取平均值，所測(cè)性狀及其對(duì)應(yīng)的編號(hào)見(jiàn)表2，其中，由于蟬花孢梗束分枝較多，選取一級(jí)分枝最長(zhǎng)的3枝測(cè)量，對(duì)于達(dá)不到3枝的個(gè)體，缺失分枝長(zhǎng)BC和分枝周長(zhǎng)BZ兩個(gè)性狀數(shù)值記為“0”。

表2 蟬花和冬蟲(chóng)夏草觀察性狀、編號(hào)Tab.2 Number of morphological traits of Isaria cicadae and Ophiocordyceps sinensis

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1 形態(tài)性狀基本統(tǒng)計(jì)量

使用SAS 8.1軟件計(jì)算蟬花和冬蟲(chóng)夏草形態(tài)性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值、最小值和變異系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)差StdDev表示形態(tài)性狀值在平均值上下波動(dòng)大小，標(biāo)準(zhǔn)差越大則反映形態(tài)性狀值離平均值波動(dòng)越遠(yuǎn)；變異系數(shù)CV（標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值）表示表型性狀值離散性程度，變異系數(shù)越大則表型性狀值離散程度越大，反映形態(tài)性狀值在居群中的整齊性程度[14]。

1.3.2 形態(tài)性狀巢式方差分析

形態(tài)性狀巢式等級(jí)方差分析[15-18]的模型為：

式中：Yijkl為第i個(gè)居群第j個(gè)單株第k次重復(fù)第l次的觀測(cè)值；μ為總體平均值；Si為第i個(gè)居群的效應(yīng)（固定）；T(i)j為第i個(gè)居群第j個(gè)單株的效應(yīng)（隨機(jī)）；R(ij)k為第i個(gè)居群第j個(gè)單株第k次重復(fù)的效應(yīng)（固定）；ε(ijk)l=ε(ijk)=試驗(yàn)誤差。

為進(jìn)一步了解蟬花形態(tài)性狀在居群間和個(gè)體間的分配情況，利用SAS 8.1進(jìn)行巢式方差分析，使用的SAS程序[18]如下：

1.3.3 形態(tài)性狀Q-聚類分析

采用AVE聚類法，對(duì)10個(gè)居群蟬花樣品形態(tài)性狀的平均值進(jìn)行居群間聚類分析，使用的SAS程序[18]如下：

表3 蟬花與冬蟲(chóng)夏草物種水平形態(tài)性狀分析結(jié)果Tab.3 The analysis results of morphologic traits of Isaria cicadae and Ophiocordyceps sinensis at species level

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征基本統(tǒng)計(jì)量

變異系數(shù)可表示表型性狀值離散性的程度，變異系數(shù)越大，則性狀值離散程度越大，反之則小。蟬花和冬蟲(chóng)夏草物種水平形態(tài)性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

10個(gè)居群的蟬花，其菌核長(zhǎng)（JC）平均值在3.18 cm～5.15 cm 之間，居群水平 CV 值為 5.93%～10.56%，物種水平 CV值為 14.91%；菌核周長(zhǎng)（ZC）平均值在2.98 cm～4.16 cm之間，居群水平CV值為 6.07%～9.97%，物種水平 CV 值為 12.97%，Pop ICKSG的菌核長(zhǎng)和周長(zhǎng)最小，Pop ICYTS的菌核長(zhǎng)和周長(zhǎng)最大，Pop ICYTS的寄主為竹蟬，Pop ICKSG的寄主是鳴鳴蟬，Pop ICWYJ的寄主是云南黑蟬，表明蟬花的菌核長(zhǎng)和周長(zhǎng)主要是與寄主直接相關(guān)的，菌核長(zhǎng)和菌核周長(zhǎng)這兩個(gè)形態(tài)性狀的CV值較小，說(shuō)明這兩個(gè)性狀穩(wěn)定，變異不大。蟬花菌核重量（JZ）平均值在 0.20 g～0.95 g 之間，CV 值為 17.35%～36.63%；孢梗束重量 （ZZ）平均值在 0.09 g～0.44 g之間，CV值為13.40%～45.79%，表明不同產(chǎn)地的蟬花的菌核和孢梗束重量有較大的差異。蟬花孢梗束一級(jí)分枝數(shù)（BR）平均值在1.7枝～3.9枝之間，CV值為38.83%～114.32%，表明蟬花孢梗束多分枝，孢梗束的分枝數(shù)變異大。分枝1長(zhǎng)（BC－1）平均值在3.05 cm～7.19 cm 之間，分枝 1 周長(zhǎng) （BZ－1）平均值在 1.26 cm～2.31 cm 之間；分枝 2 長(zhǎng) （BC－2）平均值在 1.91 cm～5.36 cm 之間，分枝 2 周長(zhǎng) （BZ－2）平均值在 0.38 cm～0.90 cm 之間；分枝 3 長(zhǎng) （BC－3）平均值在 0.50 cm～2.19 cm 之間，分枝 3周長(zhǎng) （BZ－3）平均值在0.06 cm～0.38 cm之間，蟬花12個(gè)形態(tài)性狀的變異系數(shù)（物種水平），分枝3周長(zhǎng)（BZ－3）最大，CV值為163.79%，其次為分枝3長(zhǎng)度（BC－3），CV值為162.57%，由于個(gè)體間分枝數(shù)目不一致，使得分枝相關(guān)的形態(tài)性狀變異最大。

除了與孢梗束分枝數(shù)相關(guān)性狀以外，蟬花孢梗束重量的變異系數(shù)最大（45.88%）；其次是子實(shí)體重量QZ（44.29%）；不同居群內(nèi)每一表型性狀的變異系數(shù)均有一定差異，說(shuō)明蟬花居群間由于遺傳和環(huán)境異質(zhì)性導(dǎo)致居群表型變異存在差異。所研究10個(gè)蟬花居群的12個(gè)形態(tài)性狀中，與孢梗束分枝數(shù)相關(guān)的形態(tài)性狀變異系數(shù)值均偏大，說(shuō)明這些性狀在居群內(nèi)個(gè)體間分化較大，多態(tài)性豐富，這可能與其適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

冬蟲(chóng)夏草5個(gè)居群8個(gè)形態(tài)性狀的變異系數(shù)（物種水平）在16.02%～48.44%之間。這些形態(tài)性狀中菌核重量的變異系數(shù)最大（48.44%），不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草的大小和重量等形態(tài)性狀，主要與冬蟲(chóng)夏草寄主的種類和被感染年齡有關(guān)，子座一級(jí)分枝數(shù)（BR）的變異系數(shù)為0，表明該性狀較其他性狀穩(wěn)定，冬蟲(chóng)夏草子座多單生。

2.2 巢式方差分析

巢式方差分析可以揭示居群間和居群內(nèi)的變異，而且可以劃分居群間和居群內(nèi)變異組分。蟬花形態(tài)性狀的表型分化系數(shù)（Vst）見(jiàn)表4。

表4 蟬花10個(gè)居群12個(gè)性狀巢式方差分析Tab.4 Nested variation analysis of 12 morphological traits among 10 populations of Isaria cicadae

從表4可知，蟬花菌核部分12個(gè)形態(tài)性狀在居群間的平均方差分量占33.79%，居群內(nèi)個(gè)體間的平均方差分量占總變異的66.21%，居群內(nèi)個(gè)體是形態(tài)性狀變異的主要來(lái)源。其中，菌核部分3個(gè)形態(tài)性狀在居群間的平均方差分量占69.21%，居群內(nèi)個(gè)體間的平均方差分量占總變異的30.79%，居群間的多態(tài)性大于居群內(nèi)的多態(tài)性；蟬花孢梗束部分7個(gè)形態(tài)性狀在居群間的平均方差分量占18.02%，居群內(nèi)個(gè)體間的平均方差分量占總變異的81.98%，居群內(nèi)的多態(tài)性遠(yuǎn)大于居群間的多態(tài)性，與孢梗束分枝等相關(guān)的形態(tài)性狀的差異則主要來(lái)自于個(gè)體間，同一居群不同個(gè)體的孢梗束形態(tài)性狀差異巨大，孢梗束的生長(zhǎng)除受到蟬花本身的遺傳因素影響，在生長(zhǎng)過(guò)程中環(huán)境因素的影響較大，這使得居群內(nèi)個(gè)體間的孢梗束形態(tài)變異較菌核相關(guān)形態(tài)性狀豐富。

冬蟲(chóng)夏草12個(gè)性狀中，由于測(cè)量個(gè)體的分枝數(shù)均為1枝，有效的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)有7個(gè)，詳見(jiàn)表5。

表5 冬蟲(chóng)夏草5個(gè)居群7個(gè)性狀巢式方差分析Tab.5 Nested variation analysis of 7 morphological traits among 5 populations of Ophiocordyceps sinensis

從表5可以看出，這七個(gè)性狀均表現(xiàn)為居群間方差分量大于個(gè)體間方差分量，表明居群是這些形態(tài)性狀的主要來(lái)源，居群間形態(tài)有較大的分化。冬蟲(chóng)夏草形態(tài)性狀在居群間與居群內(nèi)的分布式樣與蟬花不一樣，冬蟲(chóng)夏草形態(tài)性狀在居群間的分化大于蟬花居群間的分化。

2.3 Q-聚類分析

10個(gè)蟬花居群17個(gè)形態(tài)性狀A(yù)VE聚類法的譜系聚類圖見(jiàn)圖1。

圖1 10個(gè)蟬花居群17個(gè)形態(tài)性狀A(yù)VE聚類法的譜系聚類圖Fig.1 Q-Cluster of 17 morphological traits assayed in 10 populations of Isaria cicadae with average linkage method

由圖1可知，10個(gè)居群的蟬花聚成CladeA和CladeB兩支，在CladeB中包括9個(gè)居群的蟬花，CladeA中包括1個(gè)居群（Pop ICKSG）的蟬花。在CladeB中，產(chǎn)自蘭坪縣的7個(gè)居群（Pop ICLHH、I CLHQ、ICLZD、ICLSH、 ICLTL、 ICLHX、ICLTD）先聚成一支，再依次與Pop ICWYJ和Pop ICYTS聚在一起，聚類圖在一定程度上與地理呈相關(guān)性，表明不同居群的蟬花的形態(tài)性狀具有地域性特征。

3 討論

蟲(chóng)草菌核的大小和重量等性狀主要是受到寄主大小的影響，蟬花的寄主為同翅目的昆蟲(chóng)蟬，現(xiàn)已報(bào)道關(guān)于蟬花的寄主蟬共有8種[19]，而冬蟲(chóng)夏草的寄主為蝙蝠蛾，已報(bào)道的種類有57種[20]，冬蟲(chóng)夏草寄主的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于蟬花的寄主，這可能是冬蟲(chóng)夏草形態(tài)性狀居群間分化大于蟬花的原因之一。另外一個(gè)可能的原因是：人們?cè)诰薮蟮慕?jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，對(duì)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行破壞性的采集，導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草居群分布點(diǎn)的范圍不斷縮小，這阻礙了冬蟲(chóng)夏草居群間的基因交流，使得冬蟲(chóng)夏草居群間分化進(jìn)一步加大。由于寄主的種類直接決定蟬花和冬蟲(chóng)夏草的菌核大小，與菌核大小直接相關(guān)的性狀，如菌核長(zhǎng)（JC）、菌核周長(zhǎng)（ZC）、菌核重量（JZ）等性狀的變異要?。–V值較?。?，但受到不同產(chǎn)地的寄主種類和分化的影響，使得菌核大小直接相關(guān)的性狀在居群間形成分化。與孢梗束相關(guān)的形態(tài)性狀，如孢梗束一級(jí)分枝數(shù)（BR）、分枝1長(zhǎng)（BC-1）、分枝 2長(zhǎng) （BC-2）、分枝3長(zhǎng)（BC-3）、分枝1周長(zhǎng)（BZ-1）、分枝3周長(zhǎng)（BZ-3）、分枝3周長(zhǎng)（BZ-3）則變異較大。同一居群內(nèi)不同個(gè)體的孢梗束差異較大，可能是由于不同的個(gè)體在遺傳上的差異導(dǎo)致的，在培養(yǎng)蟬棒束孢菌絲體的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，不同的菌株在相同的培養(yǎng)條件下，其產(chǎn)孢子、產(chǎn)菌絲、產(chǎn)孢梗束的能力差異明顯，表明其在遺傳結(jié)構(gòu)上可能具有較大的差異，有必要開(kāi)展蟬花遺傳結(jié)構(gòu)的研究；另外，蟬花孢梗束的形成還受到其生長(zhǎng)環(huán)境的影響，如菌核距地表的距離、地表的枯枝落葉、地表植被等。總之，遺傳上的差異和生境的多樣性是蟬花孢梗束形態(tài)變異豐富的來(lái)源。豐富的變異一定程度上也反映了蟬花具有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境能力，這與蟬花分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)[4]的實(shí)際情況是一致的。

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