陳 彪，張 睿，張文娟，岳 磊，范戌輝，劉吉倫，劉耀強，崔 怡，屈鵬飛，楊 威

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔頜面外科,河北 石家莊 050000)

干細胞是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的細胞，可分化成多種功能細胞，在疾病治療和組織工程化方面應用的潛力巨大[1]。干細胞治療是具有臨床應用前景的重要治療手段之一。牙髓干細胞是一種成纖維細胞，研究[2]顯示:牙髓干細胞可為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，在體外可分化為神經(jīng)元，在治療時能保護并促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦細胞的生存。面神經(jīng)損傷是一種臨床上較難治療的疾病，常引發(fā)部分或完全性面癱。面神經(jīng)損傷的致病因素較多，目前尚未明確。臨床治療包括內(nèi)科治療和外科手術(shù)，內(nèi)科治療主要采用抗炎、脫水；外科手術(shù)包括面神經(jīng)吻合、面神經(jīng)減壓及自體神經(jīng)移植等。由于其周圍神經(jīng)受到局部和整體的影響，面神經(jīng)損傷后再生困難[3]。近年來，隨著顯微外科技術(shù)的不斷完善，手術(shù)修復取得進步，但由于神經(jīng)再生速度極緩慢，往往發(fā)生不可逆的肌萎縮，給恢復帶來負面影響[4]。因此如何改善神經(jīng)再生微環(huán)境、去除阻礙神經(jīng)再生的因素等成為研究者關注的方向。牙髓干細胞是存在于牙髓中具有多向分化潛能的成體干細胞，已成為全球基礎醫(yī)學界研究的熱點。牙髓干細胞具有來源廣泛、取材容易、分化能力強和免疫原性較低等特點，在臨床治療和倫理學方面均具有明顯的優(yōu)越性，作為種子細胞日益受到研究者的關注。2008年日本學者Sasaki等[5]證實了轉(zhuǎn)化生長因子可以誘導牙髓干細胞向神經(jīng)組織轉(zhuǎn)化。本研究通過切斷兔面神經(jīng)上頰支引起周圍神經(jīng)缺損建立模型，模擬人面神經(jīng)損傷，并分離牙髓干細胞對模型兔進行治療，通過檢測兔的運動功能和面神經(jīng)組織切片指標來探討牙髓干細胞移植對面神經(jīng)損傷模型的修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 普通級雄性新西蘭幼兔1只，1周齡，體質(zhì)量(1.0±0.1)kg，用于提取牙髓干細胞；普通級雄性健康新西蘭兔45只，7～8月齡，體質(zhì)量(3.0±0.5)kg；所有動物均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(新)2014-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：(25±2)℃、濕度(50±5)%。所有實驗動物均符合衛(wèi)計委一級動物標準。適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。DMEM 細胞培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，免疫組織化學DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，3%戊巴比妥鈉(武漢金諾化工有限公司)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和睫狀神經(jīng)生長因子(CNTF)單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，CNTF抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)。病理組織切片機(德國Sartorius 公司)，Leica DMI4000B 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)，Jouan BR4I 高速離心機(德國Hereaus 公司)，微量加樣器(美國Hyclone公司)。

1.2 牙髓干細胞的分離培養(yǎng)、純化和誘導分化 參照文獻[6]方法，將幼兔消毒后置于超凈工作臺上，局麻下拔除兔前牙及磨牙，采用0.1 mol·L-1PBS沖洗，無菌條件下打開牙冠，取出兔牙髓組織，反復沖洗后置于離心管中，依次加入3 g·L-1Ⅰ型膠原酶和4 g·L-1dispase 酶溶液各1 mL，37℃水浴中消化1 h，過細胞篩網(wǎng)(70 μm孔徑)，加入PBS溶液制成懸液，低溫條件下以1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，加10%血清培養(yǎng)液，調(diào)制成2×105mL-1細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，之后每3 d換液1次，待原代細胞長至底部90%時，胰酶溶液消化5 min，按1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。取第3代細胞，接種于含堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和CNTF的培養(yǎng)液中誘導培養(yǎng)分化，每日觀察細胞生長情況。

1.3 動物分組和兔面神經(jīng)損傷模型制備 將45只兔隨機分為正常對照組、模型組和實驗組，每組15只。除正常對照組外均建模，建模前兔禁食12 h，麻醉后，無菌條件下，采用兔架將兔仰臥固定于操作臺上，沿嘴角至耳前處做長約3 cm的切口，顯現(xiàn)上下頰支，顯微鏡下暴露出上頰支，離斷上頰支，建立面神經(jīng)上頰支損傷的動物模型[19-22]，然后用自制的神經(jīng)導管套接吻合缺損，兩斷端嵌入無菌神經(jīng)導管 1.5 mm 形成神經(jīng)再生室,用10-0絲線縫合固定,形成神經(jīng)導管再生室。操作完成后，逐層縫合，再次消毒，按50 000 U·kg-1注射青霉素預防性抗感染。放入兔飼養(yǎng)房內(nèi)正常飼養(yǎng)，自由活動和進食。建模1周后，采用微量加樣器向?qū)嶒灲M兔神經(jīng)導管再生室管腔內(nèi)注射0.1 mL牙髓干細胞懸液(5×106個)，模型組兔的神經(jīng)導管再生室管腔中注射等量0.1 mL PBS液。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，給予基礎飼料、自由飲水，置于溫暖、干燥、通風的環(huán)境中。正常對照組兔不作任何處理。

1.4 各組兔行為表現(xiàn)觀察和面部胡須運動功能評分 參考文獻[7]方法，于術(shù)前、術(shù)后2周觀察兔行為表現(xiàn)，觀察兔面部兩側(cè)胡須及肌肉運動情況，檢測胡須運動功能評分，評分標準：①完全癱瘓，胡須垂向后下方(0分)；②輕微胡須抖動(1分)；③輕度面部運動(2分)；④胡須及上唇中度運動(3分)；⑤上唇及胡須正常運動(4分)。

1.5 HE染色觀察兔面神經(jīng)組織病理形態(tài)表現(xiàn) 經(jīng)心臟灌注處死實驗兔，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛進行預固定，在實驗兔左右兩側(cè)頰部至耳后1.5 cm處進行消毒，切開顯露手術(shù)部位，取面神經(jīng)，迅速放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶液中，行常規(guī)HE染色，于光學顯微鏡下觀察兔面神經(jīng)組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 免疫組織化學染色觀察兔面神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù) 染色前將切片60℃、1 h二甲苯脫蠟，酒精脫水，蒸餾水水化，滴加3%雙氧水，37℃下孵育10 min，沖洗，滴加正常山羊血清工作液進行封閉，37℃下孵育10 min，除去血清，滴加一抗BDNF和CNTF抗體，4℃孵育12 h，PBS沖洗，滴加二抗工作液，37℃下孵育10 min，滴加鏈霉素卵白素工作液(辣根過氧化物酶標記后)，37℃下孵育30 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色液，顯色10 min，PBS沖洗，蘇木素復染，脫水，封片，光鏡下觀察免疫組織化學標本。鏡下呈棕黃色的神經(jīng)元則判定為陽性細胞。

1.7 透射電鏡下觀察兔面神經(jīng)組織橫切片中再生神經(jīng)纖維數(shù)、纖維直徑和髓鞘厚度 取一片干凈牙科蠟，置于潤濕平皿底內(nèi)，滴加染液于蠟塊上，蓋上蓋玻片。取組織橫切片，采用鈾-鉛雙染法：將載網(wǎng)用1%～3%醋酸雙氧鈾水染20～30 min，反復清洗。將檸檬酸鉛溶于氫氧化鈉，得強堿溶液(pH 12)，按照上述染、洗方法進行染色。染色完成后，采用0.02%氫氧化鈉和蒸餾水連續(xù)沖洗載網(wǎng)，之后置于培養(yǎng)皿的濾紙上干燥。透射電鏡下觀察計算移植后單位面積內(nèi)再生神經(jīng)纖維數(shù)、纖維直徑和髓鞘厚度，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 牙髓干細胞形態(tài)表現(xiàn) 原代幼兔牙髓細胞大多數(shù)呈成纖維狀、長梭形，少數(shù)細胞呈橢圓形，部分呈多角形，增殖后可見大量的成纖維樣細胞，細胞體積較小，細胞達到90%融合時，可見到大量的細胞分裂相。見圖1。HE染色后，第3代干細胞的細胞核呈深藍色，卵圓形；呈梭形、著色深細胞為成纖維細胞樣細胞，胞漿粉紅，著色較淺。分離純化的牙髓干細胞經(jīng)免疫組織化學染色鑒定的結(jié)果顯示：抗波形絲蛋白、牙本質(zhì)涎蛋白和CD44染色呈陽性反應。見圖2(插頁三)。

2.2 各組兔行為表現(xiàn)和面部胡須運動功能評分 正常對照組所有兔行為表現(xiàn)均正常；與正常對照組比較，術(shù)后模型組兔面部胡須運動功能評分降低(P<0.01)，表現(xiàn)為胡須垂向后下方，耳下垂，眼睛對光反射減弱，受到刺激后不能完全閉合，出現(xiàn)面神經(jīng)麻痹癥狀；與模型組比較，從第8周開始，實驗組兔面部胡須運動功能改善較快，胡須運動功能評分升高(P<0.05)。見表1。

圖1 牙髓干細胞形態(tài)表現(xiàn)(×40)

GroupMovement function score(week) 246810Normal control4.01±0.224.03±0.374.02±0.284.05±0.314.03±0.40Model0.11±0.02*0.98±0.05*1.21±0.07*1.48±0.10**2.01±0.12*Experiment 0.23±0.021.15±0.041.60±0.061.97±0.08△3.48±0.14△

*P<0.01vsnormal control group;△P<0.05vsmodel group.

2.3 兔面神經(jīng)組織現(xiàn)理形態(tài)表現(xiàn) 正常對照組兔面神經(jīng)上頰支的縱切面見神經(jīng)纖維排列整齊，呈長條狀平行排列，其外包繞髓鞘，結(jié)構(gòu)致密無明顯變化，神經(jīng)纖維束被神經(jīng)束膜包裹，呈連續(xù)性。模型組兔新生神經(jīng)纖維呈現(xiàn)不規(guī)則松散狀且數(shù)量較少。移植術(shù)后10周，實驗組兔面神經(jīng)組織切片顯微鏡下可見新生神經(jīng)纖維較多，呈束狀且緊密。見圖3(插頁三)。

2.4 各組兔面神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù) 與正常對照組比較，模型組兔面神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組兔面神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。見表2和圖4、5(插頁三)。

2.5 各組兔面神經(jīng)組織切片中再生神經(jīng)纖維數(shù)、纖維直徑和髓鞘厚度 移植術(shù)后10周，與正常對照組比較，模型組兔再生神經(jīng)纖維數(shù)、纖維直徑和髓鞘厚度明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，實驗組兔面神經(jīng)組織橫切片中再生神經(jīng)纖維數(shù)目、纖維直徑和髓鞘厚度數(shù)均明顯升高(P<0.05)。見表3和圖6。

表2 各組兔面神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù)

GroupNumber of positive cells BDNFCNTFNormal control16.63±2.5040.71±5.92Model6.78±0.97*14.95±1.74*Experiment 13.01±1.78△36.62±5.86△

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.01vsmodel group.

3 討 論

臨床上外傷、腫瘤和手術(shù)損傷等常導致面神經(jīng)損傷，引起面癱和味覺的部分損失等[8]。臨床上面神經(jīng)損傷治療以藥物保守為主，或結(jié)合顯微縫合神經(jīng)斷端，但治療效果常常不佳[9]。研究[10]顯示：面神經(jīng)損傷屬于細胞損傷的范疇，但由于神經(jīng)元不能分裂再生長，損傷后只能依靠軸突的生長延伸，生長速度較慢，再加上神經(jīng)受損后易發(fā)生萎縮、變性和纖維化，導致神經(jīng)功能恢復困難。隨著醫(yī)學科研技術(shù)的深入發(fā)展，神經(jīng)再生研究已進入細胞和分子水平。組織工程學技術(shù)對神經(jīng)生物學的研究為面神經(jīng)損傷的修復提供了新的研究方向。

表3 各組兔再生神經(jīng)纖維總數(shù)、纖維直徑和髓鞘厚度

GroupNumber of myelinated nerve fibersDiameter of fiber(l/μm) Thickness of myelin sheath(l/μm)Normal control1 044.36±91.616.09±0.520.51±0.02Model847.41±68.33*3.14±0.25*0.37±0.04*Experiment1 356.50±90.12△7.12±0.48△0.71±0.04△

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05vsmodel group.

A：Normal control group；B：Model group；C：Experiment group.

圖6 透射電鏡下各組兔面神經(jīng)組織切片中再生神經(jīng)纖維形態(tài)表現(xiàn)(×8 000)

Fig.6 Morphology of regenerated nerve fibers in facial nerve tissue section of rabbits in various groups under transmission electron microscope(×8 000)

組織工程學技術(shù)主要方法是模仿神經(jīng)組織的構(gòu)造進行局部移植干細胞，促進神經(jīng)修復的細胞，誘導或促進損傷神經(jīng)的再生與連接，從而改善或修復受損的神經(jīng)功能。

在實驗動物的選擇方面，家兔易于獲得，飼養(yǎng)方便，抗病能力強，且家兔的體形較大、面神經(jīng)直徑較粗，在結(jié)構(gòu)上與人面神經(jīng)相似，具備制作面神經(jīng)缺損模型的優(yōu)點，便于面部表情肌功能恢復的觀察和測試，近年研究[11]多以家兔作為實驗動物制作神經(jīng)缺損模型。本實驗采用目前公認的建模方法，即通過切斷動物面神經(jīng)上頰支引起周圍神經(jīng)缺損，結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組兔術(shù)后面部胡須活動均明顯減弱，表現(xiàn)為胡須垂向后下方，耳下垂，眼睛對光反射減弱，受到刺激后不能完全閉合，出現(xiàn)面神經(jīng)麻痹癥狀，說明兔面神經(jīng)損傷模型建模成功。

神經(jīng)損傷后神經(jīng)代謝的恢復和受損神經(jīng)功能的修復是神經(jīng)再生的綜合體現(xiàn)，自體神經(jīng)或異體神經(jīng)等干細胞移植是常用的神經(jīng)再生方法[12-13]。實驗[14]證明：牙髓干細胞在一定誘導條件下，可定向分化為神經(jīng)元，可作為種子細胞構(gòu)建組織工程的人工神經(jīng)，其是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要細胞，牙髓干細胞移植可產(chǎn)生一些細胞因子，對神經(jīng)功能的恢復具有促進作用。本研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)聯(lián)合牙髓干細胞可促進面神經(jīng)再生[15-16]。Huojia等[17]對新西蘭大白兔面神經(jīng)頰支人為制造約7 mm的神經(jīng)斷端，采用硅膠導管制作再生室，嘗試采用牙髓干細胞聯(lián)合TGF-β3修復面神經(jīng)損傷發(fā)現(xiàn)：此法修復面神經(jīng)損傷組兔的S100蛋白與巢蛋白Nestin高表達，進一步證實牙髓干細胞可定向分化為神經(jīng)細胞，有效修復神經(jīng)。本研究體外培養(yǎng)的原代幼兔牙髓細胞增殖能力強，增殖后可見大量的成纖維樣細胞，細胞體積較小，細胞達到90%融合時，可見到大量的細胞分裂相，原代和傳代培養(yǎng)的干細胞鑒定結(jié)果均為染色陽性。表明牙髓干細胞可作為種子細胞。本研究結(jié)果顯示：在第3代干細胞中抗波形絲蛋白、牙本質(zhì)涎蛋白和CD44染色均呈陽性反應，證實其來源為間充質(zhì)干細胞。所以本實驗選擇第3代形成的牙髓干細胞進行干細胞移植治療。

研究[18-19]證明：神經(jīng)干細胞在增殖分化產(chǎn)生神經(jīng)細胞的過程與所處的微環(huán)境信號有緊密聯(lián)系，BDNF和CNTF就是其中之一。BDNF為損傷神經(jīng)元提供營養(yǎng)，具有抗神經(jīng)損傷作用，而CNTF可促進神經(jīng)細胞生長，減少瘢痕生成，改善內(nèi)環(huán)境，促進神經(jīng)功能的恢復[20-21]。本研究結(jié)果顯示：實驗組兔神經(jīng)組織中BDNF和CNTF陽性細胞數(shù)量較多，面神經(jīng)組織橫切片中再生神經(jīng)纖維較多，呈束狀且緊密；模型組兔面神經(jīng)組織橫切片顯微鏡下再生神經(jīng)纖維呈現(xiàn)不規(guī)則松散狀且數(shù)量較少，再生神經(jīng)纖維數(shù)目較多，纖維較粗，髓鞘增厚，軸漿內(nèi)細胞器完整，只有少數(shù)脫髓鞘神經(jīng)纖維，神經(jīng)纖維間結(jié)締組織較少。本研究結(jié)果表明：牙髓干細胞可促進兔面神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能恢復，可能因為干細胞促進BDNF和CNTF的分泌及表達，改善了神經(jīng)系統(tǒng)細胞再生的微環(huán)境，同時減少了瘢痕組織生成，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，進而促進受損神經(jīng)功能的修復，其修復機制可能與上調(diào)BDNF及CNTF表達有關。

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