任艷芳，姜永杰，張秀玲，姜 姍，王玉紅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特發(fā)的以母體蛋白尿和高血壓為特征的多系統(tǒng)綜合征，是導(dǎo)致我國(guó)孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的一個(gè)重要因素，目前，該病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，治療也缺乏有效的手段[1]。滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮的增殖、侵襲和遷移是人類胎盤形成和胚胎植入的重要環(huán)節(jié)，胎盤著床的關(guān)鍵時(shí)期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力降低、細(xì)胞凋亡增加引起胎盤的淺著床是該病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路屬于Hedgehog信號(hào)家族中一員，由SHH配體、受體Ptch1和Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成，參與胚胎發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，在胚胎期的組織發(fā)育、細(xì)胞分化和器官形成過(guò)程中有重要作用，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致一系列的嚴(yán)重疾病[4-5]。目前關(guān)于SHH信號(hào)通路對(duì)PE滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚未清楚。本研究通過(guò)建立滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)培養(yǎng)模型，觀察SHH信號(hào)通路激活劑purmorphamine對(duì)細(xì)胞凋亡和侵襲的影響，旨在為PE的治療提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胎盤標(biāo)本來(lái)源 收集2014年4月—2015年6月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行選擇性剖宮產(chǎn)術(shù)的PE孕婦35例及健康產(chǎn)婦(經(jīng)檢查排除妊娠期綜合征)35人，PE孕婦參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版全國(guó)統(tǒng)編教材的診斷標(biāo)準(zhǔn)。PE孕婦平均年齡為(28.83±3.22)歲，健康產(chǎn)婦平均年齡為(28.97±3.02)歲。所有研究對(duì)象均為單胎，既往無(wú)心臟病、糖尿病、甲狀腺功能異常、高血壓和腎臟病等病史，無(wú)畸胎、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、死胎等不良孕產(chǎn)史，無(wú)產(chǎn)期服用藥物和吸煙史。所有樣本采集均經(jīng)研究對(duì)象和家屬知情同意及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人早孕期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR8/SVneo)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒和膜聯(lián)蛋白 Ⅴ-FITC(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3 標(biāo)本采集 分娩后立即剪取大小約為1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織，大量無(wú)菌生理鹽水漂洗干凈，迅速放入滅菌滅酶的凍存管，置于液氮中過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。用于蛋白抽提和Western blotting法檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) HTR8/SVneo細(xì)胞在37℃、5% CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、H/R處理組和purmorphamine+H/R處理組，purmorphamine+H/R處理細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行處理，先缺氧培養(yǎng)8 h，再常規(guī)培養(yǎng)16 h，2個(gè)循環(huán)共48 h，加入1 μmol·L-1purmorphamine孵育2 h后，再進(jìn)行H/R處理。各組細(xì)胞總培養(yǎng)時(shí)間均為48 h。

1.6 Western blotting法檢測(cè)SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 提取PE和正常妊娠晚期胎盤組織及上述3組HTR8/SVneo細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)提取蛋白的濃度，每泳道30 μg上樣量，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2、MMP-9(均按照1∶500稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋)一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗滌(3次×10 min)，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光后顯影、定影。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶相對(duì)灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的條帶相對(duì)灰度值=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，采用AnnexinⅤ-FITC/PI(碘化丙錠)雙標(biāo)記試劑盒處理細(xì)胞，采用FCM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 Transwell小室法檢測(cè)各組穿膜細(xì)胞數(shù) Transwell小室放入24孔板中，上室上層采用50 μL Matrigel膠(用磷酸鹽緩沖液按照1∶6稀釋)包被。上述3組細(xì)胞完成處理后，Transwell小室的上室中加入1×105個(gè)細(xì)胞，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)，膜清洗，行HE染色，顯微鏡下拍照，隨機(jī)取6個(gè)不同的視野(×200)觀察并記錄穿膜細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，計(jì)算每組小室穿膜細(xì)胞的平均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 PE和正常妊娠晚期胎盤組織中SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 正常妊娠晚期胎盤組織中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平分別為0.882±0.06、0.532±0.037、0.492±0.031、0.238±0.024和0.153±0.016，PE胎盤組織中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3蛋白表達(dá)水平分別為0.187±0.016、0.021±0.007、0.177±0.018、0.141±0.015和0.025±0.008，PE 胎盤組織中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常妊娠晚期胎盤組織(t=19.386，P=0.000；t=23.504，P=0.000；t=15.220，P=0.000；t=5.936，P=0.004；t=12.394，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 正常對(duì)照組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平分別為0.711±0.053、0.311±0.022、0.196±0.018、0.191±0.017和0.139±0.015，H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平分別為0.182±0.018、0.131±0.015、0.081±0.012、0.053±0.011和0.024±0.008，purmorphamine+H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平分別為0.385±0.034、0.187±0.023、0.129±0.015、0.111±0.010和0.078±0.008；H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常對(duì)照組(t=16.370，P=0.000；t=11.709，P=0.000；t=9.207，P=0.001；t=11.805，P=0.000；t=11.717，P=0.000)；purmorphamine+H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常對(duì)照組(t=16.370,P=0.000;t=11.709，P=0.000；t=9.207，P=0.001；t=11.805，P=0.000；t=11.717，P=0.000);purmorphamine+H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平均明顯高于H/R處理組(t=9.140，P=0.001；t=3.532，P=0.024；t=4.328，P=0.012；t=6.758，P=0.003；t=8.267，P=0.001)。見(jiàn)圖2。

Lane 1: Late trimester of normal pregnancy; Lane 2: PE.

圖1 PE和正常妊娠晚期胎盤組織中SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of SHH signal pathway related proteins in placental tissues of PE and late trimester of normal pregnancy

2.3 各組HTR8/SVneo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平 正常對(duì)照組、H/R處理組和purmorphamine+H/R處理組HTR/SVneo細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平分別為0.655±0.051、0.034±0.008和0.213±0.022，MMP-9蛋白表達(dá)水平分別為0.603±0.045、0.046±0.010和0.164±0.015；H/R處理組和purmorphamine+H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(t=20.836，P=0.000；t=20.928，P=0.000;t=16.709，P=0.000；t=19.210，P=0.000)；purmorphamine+H/R處理組HTR8/SVneo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平高于H/R處理組(t=13.244，P=0.001；t=11.337，P=0.000)。見(jiàn)圖3。

Lane 1: Normal control group;Lane 2:H/R treatment group;Lane 3: Purmorphamine+H/R treatment group.

圖2 各組HTR8/SVneo細(xì)胞中SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of SHH signaling pathway related proteins in HTR8/SVneo cells in various groups

Lane 1: Normal control group;Lane 2:H/R treatment group;Lane 3:Purmorphamine+H/R treatment group.

圖3 各組HTR8/SVneo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 in HTR8/SVneo cells in various groups

2.4 各組HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡率 正常對(duì)照組、H/R處理組和purmorphamine+H/R處理組細(xì)胞凋亡率分別為(3.23±0.51)%、(13.38±0.72)%和(6.88±0.63)%，H/R處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組(t=19.925，P=0.000)，purmorphamine+H/R處理組細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R處理組(t=11.768，P=0.000)。見(jiàn)圖4。

2.5 各組HTR8/SVneo細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù) 正常對(duì)照組、H/R處理組和purmorphamine+H/R處理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(1.00±0.10)、(0.35±0.08)和(0.76±0.10)個(gè)，明顯低于正常對(duì)照組(t=8.791，P=0.001)；purmorphamine+H/R處理組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于H/R處理組(t=5.545，P=0.005)。見(jiàn)圖5。

A: Normal control group; B:H/R treatment group; C:Purmorphamine+H/R treatment group.

圖4 FCM檢測(cè)各組HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡率

Fig.4 Apoptotic rates of HTR8/SVneo cells in various group detected by FCM

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05vsH/R treatment group.

圖5 各組HTR8/SVneo細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)

Fig.5 Number of transmembrane cells of HTR8/SVneo cells in various groups

3 討 論

PE是妊娠期特有的疾病，對(duì)母嬰健康造成嚴(yán)重的威脅。滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)自滋養(yǎng)的外胚層，是母-胎界面唯一一個(gè)與母體的免疫有直接接觸的胎兒細(xì)胞，在母-胎免疫耐受和胚胎植入過(guò)程中起重要作用[7]。滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化行為是胚胎發(fā)生、胎盤形成及妊娠順利完成的基本部分[8]。滋養(yǎng)細(xì)胞異常的侵襲行為可引起胎兒生長(zhǎng)受限、不明原因自然流產(chǎn)、PE和子癇等妊娠相關(guān)疾病[9-10]。因此，研究滋養(yǎng)細(xì)胞的功能對(duì)于闡明上述各類疾病的發(fā)病機(jī)制及治療效果有重要意義。

近些年對(duì)PE的研究[11-12]顯示：滋養(yǎng)細(xì)胞中一些信號(hào)通路和基因的表達(dá)異?？赡苁窃摬“l(fā)病的重要原因。如Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在PE表達(dá)降低，可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，而激活該信號(hào)通路可對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞起保護(hù)作用[13]。SHH是一種能促進(jìn)有絲分裂的信號(hào)，在Hh家族中表達(dá)最廣泛，在器官形成、胚胎發(fā)育的多個(gè)過(guò)程中起重要作用，可調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞、牙胚發(fā)育和干細(xì)胞增殖分化等多種生物學(xué)行為[14]。研究[15]顯示：Hh信號(hào)通路主要的受體、配體及轉(zhuǎn)錄因子在妊娠中期和囊胚的滋養(yǎng)外胚層的胎盤成熟過(guò)程中均有高表達(dá)，提示該通路調(diào)節(jié)囊胚著床和發(fā)育及胎盤發(fā)育，而SHH作為主要配體影響胎盤發(fā)育。研究[16]證實(shí)：對(duì)于囊胚著床和獲能Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是必須的，而Hh信號(hào)通路處于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的上游，起調(diào)節(jié)作用。本研究檢測(cè)PE胎盤組織中SHH信號(hào)通路SHH配體、受體Ptch1和Smo及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli3蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示：在PE胎盤組織中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常妊娠晚期。

胎盤的血流動(dòng)力學(xué)異?？墒咕植拷M織缺血加重，引起母體血壓升高[17]；母體血壓升高會(huì)使胎盤的血流灌注增加，引起缺血再灌注，致使胎盤內(nèi)的血管形成無(wú)法正常完成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致PE癥狀和體征[18]。本研究采用細(xì)胞H/R及SHH信號(hào)通路激活劑purmorphamine處理HTR8/SVneo細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和侵襲情況的結(jié)果顯示：H/R可明顯增加HTR8/SVneo細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞的侵襲能力(穿膜細(xì)胞數(shù)減少)，而加入SHH激活劑purmorphamine可減弱該效應(yīng)。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，可使細(xì)胞外基質(zhì)及基膜中的大多數(shù)蛋白質(zhì)降解，在滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲過(guò)程中，MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的限速步驟[19]。有關(guān)MMP-2和MMP-9的研究較多，其是參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵酶。研究[20]顯示：滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力降低時(shí)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平也降低。本研究檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：H/R可明顯降低MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，而加入SHH激活劑purmorphamine可使MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平升高。

綜上所述，激活SHH信號(hào)通路可減少PE HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡，通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)可提高細(xì)胞侵襲能力。

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