王明睿，翟秀宇 ，王 鋼，張文嵐，高寶山，周洪瀾，傅耀文

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心，吉林 長春 130021；2.運(yùn)城市中心醫(yī)院泌尿外科，山西 運(yùn)城 044000)

他克莫司作為腎移植術(shù)后抗排異反應(yīng)的一線免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外腎移植術(shù)后患者，其屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可較好地預(yù)防和治療腎移植術(shù)后急性排異反應(yīng)。但該藥物的吸收存在個(gè)體差異，且安全范圍較窄，因此提倡個(gè)體化治療[1]。近年來的多項(xiàng)研究[2-6]表明：細(xì)胞色素P450 3A(CYP3A)酶系中CYP3A5的基因多態(tài)性是影響他克莫司藥物代謝的重要因素。研究CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后他克莫司藥物代謝的影響，指導(dǎo)腎移植術(shù)后他克莫司個(gè)體化治療方案很有必要。有學(xué)者[3,6]發(fā)現(xiàn)：CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后早期他克莫司的藥物代謝有明顯影響。但絕大多數(shù)研究隨訪時(shí)間限制于術(shù)后3個(gè)月之內(nèi)，少有隨訪時(shí)間超過術(shù)后1年的研究。本研究回顧性分析吉林大學(xué)第一醫(yī)院115例腎移植術(shù)后患者的臨床資料，納入患者均完整隨訪2年，為揭示CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司藥物代謝的中遠(yuǎn)期影響提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月—2014年10月吉林大學(xué)第一醫(yī)院收治的453例腎移植術(shù)后患者，篩選出115例符合條件的患者，其中男性76例(66.09%)，女性39例(33.91%)，年齡(37.90±10.80)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI) (21.78±3.66) kg·m-2。按照CYP3A5基因型分為野生純合子組(CYP3A5*1/*1型，11例)、突變雜合子組(CYP3A5*1/*3型，46例)和突變純合子組(CYP3A5*3/*3型，58例)，CYP3A5*3型基因突變率為70.43%。記錄3組患者術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(7 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年)有效的血他克莫司濃度/劑量(C0/D)值，C0為他克莫司谷濃度(ng·mL-1)，D為患者每日每公斤體質(zhì)量所服用他克莫司毫克數(shù)(mg·kg-1·d-1)，C0/D值單位為ng·mL-1·d·kg。將3組患者同一時(shí)間點(diǎn)的C0/D值進(jìn)行兩兩比較，分析CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)C0/D值的影響；將同一基因型患者不同時(shí)間點(diǎn)的C0/D值進(jìn)行兩兩比較，分析同一基因型患者不同時(shí)間點(diǎn)C0/D值的差異。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①首次行腎臟移植手術(shù)；②年齡18～66歲；③采用他克莫司+嗎替麥考酚酯/麥考酚鈉+潑尼松三聯(lián)免疫抑制方案且維持該方案至少2年，且隨訪數(shù)據(jù)完整。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并使用CYP3A5酶誘導(dǎo)劑或抑制劑的患者；②術(shù)后發(fā)生移植腎功能延遲恢復(fù)(DGF)和失訪的患者；③合并使用腎毒性藥物的患者；④術(shù)后腎功能異常的患者(血清肌酐>300 μmol·L-1)；⑤在檢測藥物濃度前1周內(nèi)出現(xiàn)腹瀉癥狀的患者；⑥既往患有糖尿病的患者；⑦術(shù)后肝功能異常的患者；⑧術(shù)后發(fā)生急慢性排斥反應(yīng)、急性感染的患者；⑨既往患有嚴(yán)重心血管、肝臟、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及精神病等相關(guān)的疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎和原發(fā)性高血壓等)以及患有貧血、低蛋白血癥和精神性厭食癥或胃腸切除術(shù)后等影響藥物吸收的患者；⑩多器官聯(lián)合移植的患者。

1.4 誘導(dǎo)和免疫抑制方案 于手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后第4天分別給予巴利昔單抗(Basiliximab，諾華制藥有限公司)20 mg；于手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后第14天分別給予達(dá)利珠單抗(Daclizumab，羅氏制藥有限公司)1 mg·kg-1；自手術(shù)當(dāng)日起每日給予抗胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG，安斯泰來制藥有限公司)200 mg，連續(xù)給藥5～7 d(當(dāng)患者體質(zhì)量小于50 kg時(shí)，藥物劑量減至100 mg)。手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后第1天、第2天分別給予甲基強(qiáng)的松龍(輝瑞制藥有限公司)500 mg靜點(diǎn)；術(shù)后第3天起口服醋酸潑尼松片(華中藥業(yè)股份有限公司)120 mg·d-1，此后每日遞減20 mg至20 mg·d-1維持(應(yīng)用ATG的患者，術(shù)后第3天起口服醋酸潑尼松片20 mg·d-1維持)。術(shù)后第1天口服嗎替麥考酚酯(羅氏制藥有限公司)/麥考酚鈉(諾華制藥有限公司)，依據(jù)體質(zhì)量給藥(體質(zhì)量<50 kg，500/360 mg，每日2次；50 kg<體質(zhì)量<80 kg，750/540 mg，每日2次；體質(zhì)量>80 kg，1 000/720 mg，每日2次)。當(dāng)血清肌酐低于300 μmol·L-1時(shí)給予他克莫司(安斯泰來制藥有限公司)，初始劑量：他克莫司0.1 mg·kg-1·d-1。此后根據(jù)血藥濃度及生化指標(biāo)調(diào)整用藥劑量。

1.5 他克莫司血藥樣本的采集及其濃度的測定 患者于20:00口服FK506，于次日8:00服藥前空腹采取靜脈血2 mL，并置于EDTA抗凝管中。采用EMIT法檢測其濃度谷值(EMIT 2000 tacrolimus assay，SIEMENS公司)。

1.6 CYP3A5基因多態(tài)性分析 采用常規(guī)方法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，并使用CYP3A5基因分型測定試劑盒(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)檢測CYP3A5基因*1/*3多態(tài)性。依據(jù)產(chǎn)品說明書，將Buffer-Taq-DNA樣本混合液加入試劑盒提供的1-10號(hào)引物孔，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：96℃、2 min，1個(gè)循環(huán)；96℃、20 s，68℃、1 min，5個(gè)循環(huán)；96℃、20 s，65℃、50 s，72℃、45 s，10個(gè)循環(huán)；96℃、 20 s，63℃、50 s，72℃、45 s，15個(gè)循環(huán)；72℃、3 min，1個(gè)循環(huán)。取1～10號(hào)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μL，行2.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電極緩沖液為1×TBE。電泳后銀染顯色，紫外燈下判讀結(jié)果。根據(jù)試劑盒內(nèi)提供的基因型結(jié)果分型表判斷患者基因分型。CYP3A5*1/*1基因分別于第1、3、5、7和9孔位產(chǎn)生396、412、612、335及580 bp條帶，CYP3A5*1/*3基因分別于第1、3、4、5、7和9孔位產(chǎn)生396、412、412、612、335及580bp條帶，CYP3A5*3/*3基因分別于第1、4、5、7和9孔位產(chǎn)生396、412、612、335及580bp條帶。見圖1。

A:CYP3A5 *1/*1;B:CYP3A5 *1/*3;A:CYP3A5 *3/*3;Lane 1-10:PCR product.

2 結(jié) 果

2.1 腎移植術(shù)后患者基本情況 野生純合子組、突變雜合子組和突變純合子組患者BIM分別為(22.68±2.62)、(21.96±4.15) 和(21.46±3.42) kg·m-2，3組患者中男性占比分別為72.7%、60.9%和69.0%，3組患者中18～30歲者占比分別為18.2%、32.6%和34.5%，3組患者中31～42歲者占比分別為36.4%、37.0%和29.3%，3組患者中43～54歲者占比分別為27.3%、23.9%和31.0%，3組患者中55～66歲者占比分別為18.2%、6.5%和5.2%。3組患者BMI、年齡構(gòu)成比和性別構(gòu)成比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組患者不同時(shí)間點(diǎn)他克莫司C0/D值 在術(shù)后7 d、3個(gè)月、1年和2年時(shí)，野生純合子組患者的C0/D值明顯低于突變雜合子組(P=0.011，P<0.01，P=0.022，P=0.024)；在術(shù)后1和6個(gè)月時(shí)，野生純合子組與突變雜合子組患者他克莫司C0/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.159，P=0.719)；在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，野生純合子組和突變雜合子組患者他克莫司C0/D值均明顯低于突變純合子組(P<0.01)。見表1和圖2。

表1 腎移植術(shù)后各組患者不同時(shí)間點(diǎn)他克莫司的C0/D值

Groupn C0/D(ng·mL-1·mg-1·d·kg)7 d1 month3 months6 months1 year2 yearsCYP3A5*1/*11142.89±17.2070.88±34.2667.46±24.4795.26±81.3378.20±26.9180.64±27.74CYP3A5*1/*34666.08±35.80*94.98±37.45115.15±46.67*121.17±67.83110.74±54.13*112.79±51.42*CYP3A5*3/*358125.60±66.24**△195.56±118.80**△219.18±103.43**△207.74±114.22**△218.97±157.60**△231.59±156.43**△

*P<0.05,**P<0.01vsCYP3A5*1/*1 group;△P<0.01vsCYP3A5*1/*3 group.

圖2 各組患者不同時(shí)間點(diǎn)他克莫司C0/D值折線圖

Fig.2 Line chart of C0/D values of tacrolimus of patients in various groups at different time points

2.3 同一基因型患者不同時(shí)間點(diǎn)他克莫司C0/D值 野生純合子組術(shù)后7 d患者他克莫司C0/D值明顯低于術(shù)后6個(gè)月、1年和2年(P=0.004，P=0.049，P=0.036)，其余各時(shí)間點(diǎn)的C0/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；突變雜合子組術(shù)后7 d患者他克莫司C0/D值明顯低于術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年(P=0.006，P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，術(shù)后1個(gè)月患者C0/D值明顯低于術(shù)后6個(gè)月(P=0.013)，其余各時(shí)間點(diǎn)C0/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；突變純合子組術(shù)后7 d患者他克莫司C0/D值明顯低于術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年(P=0.002，P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)他克莫司C0/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

他克莫司屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可較好地預(yù)防及治療腎移植術(shù)后患者的急性排異反應(yīng)。近年，其已成為實(shí)體器官移植術(shù)后患者中使用最廣泛的免疫抑制劑[7]。但其吸收存在明顯的個(gè)體差異，安全范圍較窄，因此，國內(nèi)外各中心均提倡他克莫司的個(gè)體化治療，通過定期對(duì)移植術(shù)后患者進(jìn)行血藥物濃度監(jiān)測，以確保既達(dá)到良好的免疫抑制效果，又能避免藥物過量帶來的毒副作用。

細(xì)胞色素P450 3A(CYP3A)酶系中CYP3A5的基因多態(tài)性是影響他克莫司藥物代謝的重要因素，因此探討CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司藥物代謝的影響很有必要。CYP3A5基因位于7 號(hào)染色體上，擁有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其中CYP3A5*3位點(diǎn)最受關(guān)注，在中國漢族人群中，其突變率高達(dá)72.17%，其突變是發(fā)生在3號(hào)內(nèi)含子上，由6 986 位的A 突變?yōu)镚，野生純合子型為CYP3A5*1/*1，突變雜合子為CYP3A5*1/*3，突變純合子型為CYP3A5*3/*3[8-12]。

CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者早期他克莫司藥物代謝具有明顯的影響，然而絕大多數(shù)研究[13-14]隨訪時(shí)間限制于術(shù)后3個(gè)月之內(nèi)，少有隨訪時(shí)間超過術(shù)后1年的研究，因此，探討CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者中長期他克莫司藥物代謝的影響具有重要的意義。本研究采取較為嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)，且患者完整隨訪2年，以期盡可能減少影響本研究準(zhǔn)確性的因素。

本研究結(jié)果顯示：CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司藥物代謝有重要的影響，且這種影響不僅限于此前研究所認(rèn)為的術(shù)后前3個(gè)月，而且術(shù)后2年時(shí)其對(duì)他克莫司藥物代謝的影響仍較明顯，因此CYP3A5基因多態(tài)性分析不能僅限于指導(dǎo)移植術(shù)后早期他克莫司用藥方案，也推薦用于指導(dǎo)移植術(shù)后穩(wěn)定期的他克莫司用藥方案。本研究結(jié)果顯示：CYP3A5不同基因型者之間C0/D值表現(xiàn)為：野生純合子型<突變雜合子型<突變純合子型，因此建議對(duì)于CYP3A5基因型為野生純合子型(*1/*1)的患者，適當(dāng)增加其他克莫司的初始劑量，并適當(dāng)提高監(jiān)測血藥物濃度的頻率，以期更快地達(dá)到目標(biāo)濃度，且避免藥物過量帶來的毒副作用。同時(shí)對(duì)于他克莫司無法達(dá)到目標(biāo)濃度的野生純合子型患者，建議及時(shí)更換免疫抑制方案，如環(huán)孢素(CSA)。研究[15-17]顯示：CSA的藥物代謝與CYP3A5基因多態(tài)性的關(guān)系并不明顯。因此本課題組針對(duì)部分CYP3A5基因型為*1/*1的患者，術(shù)后即開始采用CSA+嗎替麥考酚酯/麥考酚鈉+潑尼松三聯(lián)免疫抑制方案，據(jù)本中心臨床經(jīng)驗(yàn)，該部分患者的術(shù)后不良事件發(fā)生率并未增多，且患者能較早地達(dá)到CSA的目標(biāo)血藥物濃度，但因該類患者病例數(shù)較少，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以評(píng)估該治療方案的優(yōu)劣。

本研究結(jié)果顯示：無論何種基因型，均不同程度存在隨時(shí)間延長C0/D值逐漸升高并趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象。研究[18]證實(shí)：在移植術(shù)后的恢復(fù)期，患者他克莫司的藥物動(dòng)力學(xué)會(huì)有所改變。Hu等[19]發(fā)現(xiàn)：紅細(xì)胞比容(HCT)和血紅蛋白濃度(HGB)均與血中他克莫司的濃度有關(guān)聯(lián)。Hamim 等[20]研究證實(shí)：HCT和HGB水平越高，他克莫司的清除率越低，這與他克莫司在血液中與紅細(xì)胞廣泛結(jié)合有關(guān)聯(lián)，而HCT或HGB水平升高使進(jìn)入紅細(xì)胞的他克莫司隨之增加，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟對(duì)藥物的清除減慢，同時(shí)紅細(xì)胞中大量結(jié)合的藥物亦可使全血中他克莫司的濃度升高。器官移植術(shù)后恢復(fù)期患者上述指標(biāo)多與穩(wěn)定期有較大差異，因此當(dāng)患者的臨床狀況改善時(shí)，他克莫司在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)會(huì)有相應(yīng)改變。移植術(shù)后早期患者胃腸功能尚未完全恢復(fù)，腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長，使少量的他克莫司轉(zhuǎn)運(yùn)至低表達(dá)CYP3A的回腸而引起藥物濃度降低。張關(guān)敏等[21]研究發(fā)現(xiàn)：術(shù)后隨著時(shí)間延長，他克莫司的清除率呈緩慢降低趨勢。張鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)：在術(shù)后早期激素用量與C0/D值呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能是因?yàn)樾g(shù)后早期較大量的激素應(yīng)用可以誘導(dǎo) CYP3A酶系的表達(dá)而加速了他克莫司的代謝清除。他克莫司與紅細(xì)胞的結(jié)合是非線性的[23-24]，當(dāng)他克莫司劑量減低時(shí)，其清除率可能也隨之降低。因此，隨著腎移植術(shù)后時(shí)間的延長，其激素與免疫抑制劑用量逐漸減少，HGB和HCT水平逐漸升高，胃腸道功能逐漸恢復(fù)，體內(nèi)他克莫司的清除率和(或)生物利用率的改變亦可部分解釋上述現(xiàn)象，但有無其他因素參與其中及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。除遺傳背景外，上述因素也應(yīng)該作為他克莫司個(gè)體化治療的參考因素。

本研究為回顧性單中心研究，樣本量有限，未來有必要行前瞻性研究或多中心的聯(lián)合研究以期得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 戴立波,楊宏昕,韓曉芳,等.他克莫司治療藥物監(jiān)測與合理用藥分析[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2017,17(57):109,112.

[2] Chen JS,Li LS,Cheng DR,et al.Effect of CYP3A5 genotype on renal allograft recipients treated with tacrolimus[J].Transplant Proc,2009,41(5):1557-1561.

[3] 付生軍,劉 靜,李 濤,等.CYP3A5基因型與腎移植患者他克莫司血藥濃度關(guān)系的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(12):1440-1445.

[4] Hirano K,Naito T,Mino Y,et al.Impact of CYP3A5 genetic polymorphism on cross-reactivity in tacrolimus chemiluminescent immunoassay in kidney transplant recipients[J].Clin Chim Acta,2012,414:S120-S124.

[5] Coto E,Tavira B.Pharmacogenetics of calcineurin inhibitors in renal transplantation[J].Transplantation,2009,88(3 Suppl):S62-S67.

[6] 趙富磊,李 騫,張 峻.基因多態(tài)性對(duì)腎移植患者他克莫司藥代動(dòng)力學(xué)影響的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2017,33(23):2489-2491.

[7] Meier-Kriesche HU,Li S,Gruessner RW,et al.Immunosuppression: evolution in practice and trends,1994-2004[J].Am J Transplant,2006,6(5pt2):1111-1131.

[8] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南(試行)概要[J].實(shí)用器官移植電子雜志,2015,3(5):257-267.

[9] Li D,Zhang GL,Lou YQ,et al.Genetic polymorphisms in MDR1 and CYP3A5 and MDR1 haplotype in mainland Chinese Han,Uygur and Kazakh ethnic groups[J].Clin Pharm Ther,2007,32(1):89-95.

[10]李 敏,李 峰,高 鑫.基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度影響的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2017,34(2):162-164.

[11]丁 晴,馮端浩.CYP3A5基因多態(tài)性與臨床合理用藥[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(5):435-438.

[12]陳 晨,張晏潔,賀小露,等.他克莫司個(gè)體化用藥指南解讀[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2017,30(4):342-347.

[13]張小東,張際青,尹 航,等.CYP3A5基因型對(duì)腎移植受者術(shù)后早期血他克莫司濃度的影響[J].中華器官移植雜志,2009,30(12):717-721.

[14]林 玲,宋文利,沈中陽,等.腎移植受者C YP3A5*3和CYP3A4*18B對(duì)他克莫司藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中華器官移植雜志,2012,33(4)：220-224.

[15]潘曉東,陳文偉,倪曉潔,等.藥物代謝酶CYP3A5基因多態(tài)性與腎移植術(shù)后他克莫司和環(huán)孢素A早期臨床療效的相關(guān)性[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2014,28(6):892-897.

[16]程曉莉,李志榮,顏學(xué)滔.CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)環(huán)孢素藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(8):636-639.

[17]孫 搏,郭彥琨,高君偉,等.CYP3A基因多態(tài)性與腎移植術(shù)后不同時(shí)期環(huán)孢素濃度劑量個(gè)體差異的相關(guān)性研究[J].中國藥師,2017,20(1):91-93.

[18]何 霞,童榮生,肖開春,等.他克莫司血藥濃度影響因素的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè),2011,20(11):80.

[19]Hu RH,Lee PH,Tsai MK.Clinical influencing factors for daily dose,trough level,and relative clearance of tacrolimus in renal transplant recipients[J].Transplant Proc,2000,32(7):1689-1692.

[20]Zahir H,McLachlan AJ,Nelson A,et al.Population pharmacokinetic estimation of tacrolimus apparent clearance in adult liver transplant recipients[J].Ther Drug Monit,2005,27(4):422-430．

[21]張關(guān)敏,李 良,陳文倩,等.他克莫司在中國腎移植患者中的群體藥物動(dòng)力學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2008, 43(7):695-701.

[22]張 鑫,劉志紅,鄭敬民,等.腎移植患者他克莫司血藥濃度的影響因素[J].腎臟病與透析腎移植雜志, 2005,14(4):333-338.

[23]Chow FS,Piekoszewski W,Jusko WJ.Effect of hematocrit and albumin concentration on hepatic clearance of tacrolimus (FK 506) during rabbit liver perfusion[J].Drug Metab Dispos,1997,25(5):610-616.

[24]張大偉，許 亮，徐俊楠，等.腎移植受者術(shù)前甘油三酯代謝對(duì)移植腎早期功能恢復(fù)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2017,42(5):427-431.