周劉祥，林 琳，胡鑫敏，王曉春

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系中心實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410013)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其在中國居腫瘤發(fā)病率的第5位，居腫瘤死亡率的第3位，特別是晚期結(jié)直腸癌患者生存率較低，需要進(jìn)行深入研究[1-2]。2001年研究者[3]發(fā)現(xiàn)一種可以特異性促進(jìn)內(nèi)分泌腺源毛細(xì)血管生長的內(nèi)分泌腺性血管內(nèi)皮生長因子(endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor,EG-VEGF)，與已知的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有相似作用，還可特異性地促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮，因此也命名為前動力蛋白1(prokineticin 1，PROK1)。EG-VEGF在結(jié)腸癌組織中表達(dá)，在結(jié)腸癌組織的增殖和血管形成中扮演重要角色；EG-VEGF可通過絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶B等信號通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖、周期及遷移[4-6]。董延琥等[7]發(fā)現(xiàn)：EG-VEGF在結(jié)腸癌組織中呈陽性表達(dá),且與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)；Goi等[8]發(fā)現(xiàn)：VEGF和EG-VEGF在結(jié)腸癌組織中共表達(dá)時患者預(yù)后差，但VEGF和EG-VEGF是結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因子。EG-VEGF對結(jié)腸癌的作用使其成為結(jié)腸癌免疫治療的潛力因子。干擾EG-VEGF基因，或者加入EG-VEGF抗體可探討其與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)系。本研究首次采用逆向思維將EG-VEGF與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)，探討EG-VEGF對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、周期及遷移的影響，為結(jié)腸癌的免疫治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞購于中南大學(xué)高等研究中心細(xì)胞庫。RPMI 1640、2.5 g·L-1胰酶、不含EDTA的2.5 g·L-1胰酶和胎牛血清(美國Gibico公司)，二甲基亞砜(DMSO)和噻唑藍(lán)(美國Sigma公司)，EG-VEGF(美國Peprotech公司)，結(jié)晶紫和4%多聚甲醛(中國Biosharp公司)。超凈工作臺和酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific 公司)， 普通離心機(jī)、高速離心機(jī)和-80 ℃冰箱(美國Eppendorf 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合率達(dá)90%以上時，以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，按照 1∶2傳代，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度鋪板后置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組和處理 培養(yǎng)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞并隨機(jī)分為對照組(吸取原有培養(yǎng)基，加入含 10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基或無血清RPMI 1640培養(yǎng)基)和EG-VEGF組(吸取原有培養(yǎng)基，加入含有50、100和200 μg·L-1EG-VEGF的培養(yǎng)基)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48和72 h，然后分別根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)需求，測定各組LoVo細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移率。

1.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測各組LoVo細(xì)胞的增殖活性 采用50、100和200 μg·L-1EG-VEGF分別處理結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞作為50、100和200 μg·L-1EG-VEGF組，不加入EG-VEGF的LoVo細(xì)胞為對照組，每組設(shè) 6 個復(fù)孔。取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌 3 次，采用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，采用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，于37℃、1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為 20 000 mL-1，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)過夜，第2天加入含有EG-VEGF的細(xì)胞培養(yǎng)液，并在 24、48、72和96 h(即EG-VEGF處理24、48 、72 和 96 h )4個時間點(diǎn)時每孔加入20 μL MTT 試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育4 h后，吸去每孔中培養(yǎng)基后加入 100 μL DMSO充分溶解。采用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。以A值表示細(xì)胞增殖活性。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組不同細(xì)胞周期結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞百分率 結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞接種于 6 孔板中( 2×105mL-1) ，貼壁12 h后分組，對照組不加EG-VEGF培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入100 μg·L-1EG-VEGF于培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液， 每個樣本細(xì)胞濃度為( 1 ～ 2)×106mL-1，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，采用70%乙醇于-20℃冰箱過夜固定，次日送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司流式細(xì)胞周期檢測。采用NovoExpress 1.1.0軟件分析計(jì)算細(xì)胞周期中各期細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移率 采用Marker筆在24孔板背后均勻地劃橫線，橫穿過孔，每孔2條線。首先在孔中加入約5×105mL-1對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞；第2天采用槍頭比對直尺盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭不能傾斜，并采用PBS輕輕沖洗3次，洗去漂浮的細(xì)胞，照相，此刻測量1個距離后，對照組只加無血清培養(yǎng)液(不加入EG-VEGF)，實(shí)驗(yàn)組加入100 μg·L-1EG-VEGF于無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后照相并再次測量細(xì)胞爬行距離，在倒置顯微鏡下觀測劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(初始劃痕寬度-實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移數(shù) 選擇不同濃度(50、100和200 μg·L-1)EG-VEGF處理的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞為50、100和200 μg·L-1EG-VEGF組，不加EG-VEGF的LoVo細(xì)胞為對照組，每組設(shè) 3個復(fù)孔。取對數(shù)生長期細(xì)胞采用 PBS 洗滌 3 次，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化反應(yīng)，含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105mL-1，在Transwell 小室的下室加入600 μL含不同濃度(50、100和200 μg·L-1)EG-VEGF的培養(yǎng)基，在上室加入100 μL 混勻的細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，采用棉簽小心擦去膜上面的細(xì)胞，PBS 洗滌3次后晾干，采用顯微圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行觀察并照相，隨機(jī)選取6個低倍視野(×100)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖活性 3種不同濃度(50、100和200 μg·L-1)EG-VEGF培養(yǎng)液處理結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞12、24和72 h時，與對照組比較，各濃度EG-VEGF組LoVo細(xì)胞增殖活性(A值)雖升高但不明顯；而在48 h時EG-VEGF組細(xì)胞增殖活性(0.567±0.004、0.676±0.006、0.732±0.007)明顯高于對照組(0.481±0.003)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著EG-VEGF濃度的升高，細(xì)胞增殖活性升高，但100和200 μg·L-1EG-VEGF組細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此本研究選擇100 μg·L-1作為實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。見圖1。

*P<0.05 control group.

Fig.1 Proliferation activities of colon cancer LoVo cells in various groups

2.2 2組不同細(xì)胞周期結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞百分率 與對照組比較，100 μg·L-1EG-VEGF組G0/G1期LoVo細(xì)胞百分率降低(P<0.05)，S期LoVo細(xì)胞百分率升高(P<0.05)，G2+M期LoVo細(xì)胞百分率變化不明顯。見圖2(插頁三)和表1。

表1 各組不同細(xì)胞周期結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞百分率

GroupPercentage of LoVo cellsG0/G1SG2+MControl44.28±0.2841.68±0.3714.04±0.25100 μg·L-1 EG-VEGF38.85±0.17*51.05±0.57*10.10±0.14

*P<0.05vscontrol group.

2.3 2組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移率 24 h 時與對照組細(xì)胞遷移率(37.71%±0.63%)比較，100 μg·L-1EG-VEGF組LoVo細(xì)胞遷移率(18.97%±0.23%)明顯升高(P<0.05)。見圖3(插頁三)。

2.4 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移數(shù) 結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞處理24 h后，與對照組(232.00±3.51)比較，50、100和200 μg·L-1EG-VEGF組遷移細(xì)胞數(shù)(282.00±4.00、376.00±6.08、426.00±6.55)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖4(插頁三)。

3 討 論

結(jié)腸癌的惡性結(jié)果通常是由多種基因和蛋白質(zhì)調(diào)控其惡性行為導(dǎo)致的，如VEGF和EZH2增殖基因[9-10]等。EG-VEGF作為與VEGF有相似作用效果但作用方式不同的細(xì)胞因子，在結(jié)腸癌、絨毛膜癌、浸潤性小管癌及胰腺癌等腫瘤組織中均有表達(dá)[11-13]。研究者[14-15]將EG-VEGF抗體處理的高表達(dá)EG-VEGF的結(jié)腸癌(HCT116、LoVo和DLD-1)細(xì)胞注射到小鼠皮下后發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，其腫瘤的大小及血管形成明顯被抑制。

本研究結(jié)果顯示：EG-VEGF可明顯增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，改變結(jié)腸癌的細(xì)胞周期，說明EG-VEGF的表達(dá)加劇了結(jié)腸癌的惡性結(jié)果。為了驗(yàn)證EG-VEGF與結(jié)腸癌惡性行為的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室已成功沉默HT29細(xì)胞的EG-VEGF基因，驗(yàn)證其在沉默的條件下增殖能力及遷移能力減弱[16]。本研究利用克隆的小分子蛋白質(zhì)體外模擬體內(nèi)EG-VEGF對結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，選取結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞作為研究對象，與對照組比較，EG-VEGF組細(xì)胞增殖活性明顯升高并隨濃度的升高其增殖效果越明顯，且G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低，S期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。針對EG-VEGF對結(jié)腸癌惡性行為的具體影響機(jī)制及通路的研究仍較少，研究[17-18]表明：EG-VEGF通過EG-VEGF受體2、基質(zhì)金屬蛋白酶2和基層金屬蛋白酶9增加細(xì)胞的遷移能力，提出EG-VEGF受體2可作為結(jié)腸癌預(yù)后的診斷因子，其惡性行為的具體機(jī)制及通路在胰腺癌中也有相似的研究[13]結(jié)果。有研究者[19]建議將EG-VEGF作為生物治療方法應(yīng)用于腫瘤的的治療中，本文作者認(rèn)為EG-VEGF對腫瘤惡性行為影響的通路需要更深入的研究。

EG-VEGF影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移，其機(jī)制很可能通過是促進(jìn)其細(xì)胞增殖和遷移等惡性行為影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后[20-21]。本研究的不足之處是對結(jié)腸癌其他惡性行為如凋亡等的研究尚未涉及。EG-VEGF對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用隨濃度增加而增加，提示結(jié)腸癌中EG-VEGF表達(dá)水平與不良預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系，EG-VEGF促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及遷移是結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，這可為結(jié)腸癌預(yù)后評估及晚期治療提供新的思路和視角。

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