程逍妹，陳子廷，顏志波，趙培雅，王方海，李廣宏

( 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)(俗稱南美白對蝦)是世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的三大對蝦之一，也是中國對蝦養(yǎng)殖的優(yōu)勢種類，占中國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%以上[1]。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大與集約化程度的不斷提高，對蝦的病害也頻繁發(fā)生，導(dǎo)致成活率過低，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失?？股仉m然能夠有效預(yù)防和治療各種疾病，但長期大量使用抗生素和化學(xué)藥物必將造成環(huán)境污染、藥物殘留、抗藥性菌株產(chǎn)生和對蝦品質(zhì)下降等一系列問題，嚴(yán)重影響對蝦產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。因此,改善對蝦動物營養(yǎng)狀況以促進(jìn)對蝦生長，提高對蝦免疫功能和機(jī)體防御能力而達(dá)到防治疾病的目的，已成為越來越多研究工作者所關(guān)注的課題。

家蠅(Muscadomestica)幼蟲(俗稱蠅蛆)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、幾丁質(zhì)、多種維生素、礦物元素以及抗菌活性物質(zhì)，不僅是一種優(yōu)質(zhì)的動物性蛋白飼料源，也是一種新型的蛋白類免疫增強(qiáng)劑，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景[2-3]。近年來，已研究了鮮活蠅蛆、蠅蛆粉或蠅蛆抗菌肽對凡納濱對蝦生長性能、體成分及免疫的影響。王娓等[4]以鮮蠅蛆喂養(yǎng)凡納濱對蝦，其有效激活了對蝦酚氧化酶系統(tǒng)，提高了對蝦抵抗病毒感染的能力。劉麗波等[5]用鮮活蠅蛆等量替代人工配合飼料養(yǎng)殖凡納濱對蝦,發(fā)現(xiàn)用25%～50%鮮活蠅蛆代替相應(yīng)質(zhì)量的配合飼料，對蝦生長未受影響，并在一定程度上提高了對蝦的免疫力。曹俊明等[6]用蠅蛆粉等氮替代20%～60%的魚粉，凡納濱對蝦的生長性能和飼料系數(shù)與對照組差異不顯著，但對蝦肥滿度和存活率卻高于對照組。鄧田芳等[7]用蠅蛆粉等氮替代凡納濱對蝦飼料中部分魚粉，當(dāng)蠅蛆粉添加量<7%時，可提高試驗(yàn)蝦生長性能，但餌料系數(shù)差異不顯著，而超過這一添加量時，生長性能下降，餌料系數(shù)提高。李志杰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，用15%蠅蛆粉等氮替代魚粉，凡納濱對蝦的生長性能極顯著高于對照組。李林等[9]在飼料中添加家蠅抗菌肽提高了凡納濱對蝦抗白斑綜合征病毒的能力。陳冰等[10]在飼料中添加適量的家蠅抗菌肽對凡納濱對蝦有一定的促生長作用，顯著提高蝦體的粗蛋白和灰分含量及免疫相關(guān)指標(biāo)。以上研究結(jié)果說明，蠅蛆或蠅蛆粉可代替部分商品飼料或魚粉養(yǎng)殖對蝦；使用適量蠅蛆、蠅蛆粉或蠅蛆抗菌肽養(yǎng)殖凡納濱對蝦，在一定程度上可提高對蝦免疫力。但是，給凡納濱對蝦直接投喂鮮蠅蛆，部分蠅蛆漂浮于水面上，長期使用易污染養(yǎng)殖水體；蠅蛆粉一般經(jīng)高溫干燥，破壞了許多活性物質(zhì)，免疫調(diào)節(jié)功能大大降低甚至完全喪失；而蠅蛆抗菌肽經(jīng)提取、分離和干燥等工序處理后，成本極高。鑒于此，筆者開發(fā)了一種可在常溫下保存的液態(tài)蠅蛆蛋白對蝦免疫增強(qiáng)劑，經(jīng)養(yǎng)殖應(yīng)用，效果良好。

1 材料與方法

1.1 材料

蠅蛆蛋白由江門龍?jiān)纯萍加邢薰咎峁环布{濱對蝦蝦苗為活力強(qiáng)、飽滿度好及規(guī)格整齊的一代蝦苗，購自正大集團(tuán)珠海種苗場；基礎(chǔ)飼料為廣東海大集團(tuán)生產(chǎn)的“容川”牌南美白對蝦配合飼料，粗蛋白含量≥40%；血清檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 蠅蛆蛋白及蠅蛆蛋白飼料配制

將收取的蠅蛆磨成漿，濃縮，再按一定比例配以卵磷脂、殼寡糖和多種維生素等，制成蠅蛆蛋白。投喂前將蠅蛆蛋白按20%比例添加到凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料中，混合均勻，室溫晾干，制成蠅蛆蛋白飼料。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于 2013 年12月至2014年5月在江門市新會區(qū)禮樂鎮(zhèn)4口條件相近的池塘中進(jìn)行。每個池塘面積5000 m2，配備 1.75 kW 葉輪式增氧機(jī)3臺。各試驗(yàn)池放養(yǎng)密度均為9.0×109尾/hm2，投苗20 d后，2口養(yǎng)殖池塘投喂基礎(chǔ)飼料，剩余2口投喂20%蠅蛆蛋白+基礎(chǔ)飼料，在8:00、14:00及18:00投喂，投餌量為對蝦體質(zhì)量的5%～10%。供試蝦池的飼養(yǎng)管理一致。試驗(yàn)為期150 d，重復(fù)2次。

1.2.3 測定指標(biāo)與方法

1.2.3.1 生長指標(biāo)

試驗(yàn)開始(投苗后第20 d)和結(jié)束時從各試驗(yàn)池隨機(jī)取樣50尾蝦，測量體質(zhì)量、體長；試驗(yàn)結(jié)束時，測量各試驗(yàn)池對蝦產(chǎn)量，計(jì)算體長增長率、相對體質(zhì)量增加率、飼料系數(shù)、成活率。

體長增長率/%=[(L2-L1)/L1]×100%

相對體質(zhì)量增加率/%=[(m2-m1)/m1]×100%

飼料系數(shù)=[m3/(m2-m1)]

成活率/% = (n2/n1)×100%

式中，L1為試驗(yàn)初始體長；L2為試驗(yàn)終末體長；m1為試驗(yàn)初始體質(zhì)量；m2為試驗(yàn)終末體質(zhì)量；m3為攝食飼料質(zhì)量；n1為試驗(yàn)初始尾數(shù)；n2為試驗(yàn)?zāi)┐婊顢?shù)。

1.2.3.2 非特異性免疫指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束時，從各試驗(yàn)池隨機(jī)取45尾蝦，用酒精棉球消毒并吸干取血部位表面水分，用1 mL的一次性無菌注射器針頭平斜插入圍心腔內(nèi)抽取對蝦血淋巴液，置2 mL的滅菌離心管中(每一管混合15尾對蝦血淋巴)，4 ℃靜止2 h，3000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定血清中超氧化物岐化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和溶菌酶，測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。血清酚氧化物酶活性的測定參考Ashida[11]的方法。

1.2.3.3 肌肉營養(yǎng)成分

試驗(yàn)結(jié)束時，從各試驗(yàn)池隨機(jī)取樣100尾，每個試驗(yàn)池取對蝦肌肉300 g制成3份肌肉樣品，每份肌肉樣品100 g，用生理鹽水(0.86%)洗凈、吸干后，放入-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，用于測定肌肉營養(yǎng)成分。

對蝦肌肉主要營養(yǎng)成分及氨基酸組成由廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站測定。粗蛋白采用微量凱氏定氮法(GB 5009.5—2010) 測定；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003) 測定；水分采用105 ℃烘箱干燥法(GB 5009.3—2010) 測定；灰分采用550 ℃高溫灼燒法(GB 5009.4—2010) 測定；氨基酸測定采用酸水解法(色氨酸用NaOH水解)(GB/T 5009.124—2003)測定；脂肪酸采用氣相色譜法(GB/T 17377—2008)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，Duncan′s多重比較法分析試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦生長性能的影響

投喂添加有蠅蛆蛋白的飼料后，凡納濱對蝦的增長率、相對體質(zhì)量增加率和存活率明顯提高(表1)。試驗(yàn)結(jié)束時對照組的增長率為(287.80±15.6)%，相對體質(zhì)量增加率為(5161.11±32.82)%，存活率為(52.89±4.22)%； 而添加蠅蛆蛋白組的體長增長率、相對體質(zhì)量增加率和存活率分別達(dá)(310.51±11.39)%、(6383.33±20.54)%和(64.61±3.47)%，與對照組差異顯著(P<0.05)；飼料系數(shù)則添加蠅蛆蛋白組顯著低于對照組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加蠅蛆蛋白具有促進(jìn)凡納濱對蝦生長及降低飼料系數(shù)的作用。

表1 凡納濱對蝦攝食添加蠅蛆蛋白飼料時的生長性能

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同英文字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響

凡納濱對蝦血清中非特異性免疫指標(biāo)測定結(jié)果見表2。與對照組相比，添加蠅蛆蛋白組對蝦的超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化物酶和溶菌酶活性均顯著提高(P<0.05)。

2.3 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦肌肉成分的影響

飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦粗脂肪、灰分和水分含量影響不顯著(P>0.05)，而對粗蛋白含量影響顯著(P<0.05)( 表3)。

攝食添加蠅蛆蛋白的飼料時，凡納濱對蝦肌肉中氨基酸總含量、必需氨基酸總量、鮮味氨基酸總量以及必需氨基酸占總氨基酸的比值均顯著高于對照組(P<0.05)(表4)。說明利用蠅蛆蛋白養(yǎng)殖的凡納濱對蝦不僅有效提高了蝦的營養(yǎng)價值，同時還增加了蝦的鮮度。經(jīng)品嘗，用蠅蛆蛋白養(yǎng)殖的凡納濱對蝦比普通飼料養(yǎng)殖的更鮮美，肉質(zhì)更緊實(shí)。

表2 凡納濱對蝦攝食添加蠅蛆蛋白飼料時的非特異性免疫指標(biāo) U/mL

表3 凡納濱對蝦攝食添加蠅蛆蛋白飼料時肌肉中的主要營養(yǎng)成分 %

表4 凡納濱對蝦攝食添加蠅蛆蛋白飼料時肌肉氨基酸組成(干質(zhì)量) %

注：*必需氨基酸，**呈味氨基酸.

3 討 論

3.1 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦生長性能的影響

無論是鮮品，還是干粉，蠅蛆的粗蛋白質(zhì)含量均與鮮魚或魚粉相近。作為一種非常規(guī)蛋白源，蠅蛆粉具有蛋白含量高、氨基酸平衡性好、誘食性強(qiáng)、抗菌肽含量高等特點(diǎn)，是一類應(yīng)用前景非常廣闊的功能性動物蛋白原料，在對蝦養(yǎng)殖上的應(yīng)用也越來越受到重視。劉麗波等[5]用25%～50%鮮活蠅蛆等量替代人工配合飼料[12]；高曉云[13]在對蝦人工配合飼料中分別去掉全部、50%、40%的魚粉,再用等量鮮活蠅蛆代替，結(jié)果均不影響凡納濱對蝦的生長。研究發(fā)現(xiàn)，雖然采用蠅蛆粉或蠅蛆蟲肽蛋白粉等氮適量替代飼料中的魚粉，可提高凡納濱對蝦的生長性能，但更多的報(bào)道是替代后的養(yǎng)殖效果與完全用魚粉的相當(dāng)[6-8,15]。但在目前鮮蛆與蠅蛆粉生產(chǎn)成本比鮮魚或魚粉高的情況下，期望以鮮蛆或蠅蛆粉替代魚粉而在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用尚難以實(shí)現(xiàn)，而本試驗(yàn)采取在基礎(chǔ)飼料中添加蠅蛆蛋白的方式，研究了蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦生長性能的影響。結(jié)果表明，在飼料中20%添加蠅蛆蛋白，無論是終末體質(zhì)量、相對體質(zhì)量增加率及成活率，還是飼料系數(shù)等均優(yōu)于對照組。說明采取添加的方式更能使蠅蛆蛋白體現(xiàn)出良好的營養(yǎng)與免疫作用。本研究結(jié)果與鄭偉等[14,26]在中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)上的應(yīng)用效果一致，說明采取添加或補(bǔ)充的方法有助于促進(jìn)對蝦生長和提高對蝦成活率；而與劉麗波等[5，13]的結(jié)果不一致，推測可能與應(yīng)用方法不同有關(guān)，劉麗波等[5，13]均采用鮮蛆等量替代人工配合飼料或魚粉，由于鮮蛆蛋白質(zhì)含量約為14%～15%，低于人工配合飼料或魚粉的含量，等量替代必將因?qū)ξr攝入的蛋白數(shù)量減少而難以達(dá)到促生長的效果。蠅蛆粉或蟲肽蛋白粉等氮替代魚粉多數(shù)報(bào)道養(yǎng)殖效果與魚粉相當(dāng)，未體現(xiàn)促生長的作用，推測與蠅蛆粉中含一定比例的幾丁質(zhì)有關(guān)。昆蟲幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通過β-1，4糖苷鍵聚合而成的高分子化合物，與魚粉等氮替代時，替代飼料中的真蛋白質(zhì)必然會降低而影響?zhàn)B殖效果。經(jīng)核算，雖然在飼料中添加蠅蛆蛋白，飼料成本有一定程度增加，但養(yǎng)殖效率提高，養(yǎng)殖成本反而降低，養(yǎng)殖收益率明顯增加。本研究僅做了添加20%蠅蛆蛋白對生長性能的影響，該添加量是否最為適宜，尚有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響

對蝦為無脊椎動物，沒有特異性淋巴細(xì)胞，不能分泌免疫球蛋白[16]，體液免疫機(jī)制是抵抗病原菌入侵的第一道屏障[17-18]?？刮⑸镆蜃又饕茄馨椭械母鞣N酶，包括酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶等，它們以不同的途徑消滅異物并抵御病原體的侵襲。

酚氧化物酶是酚氧化酶原被激活后產(chǎn)生的一種酶類。它通過多種方式參與宿主的防御反應(yīng)，包括提高調(diào)理素、促進(jìn)血細(xì)胞吞噬作用、包囊作用和結(jié)節(jié)形成以及介導(dǎo)凝集和凝固、產(chǎn)生殺菌物質(zhì)等[19-20]。溶菌酶主要來自血液，是一種堿性蛋白。它通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4 糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽而導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，逸出內(nèi)容物，使細(xì)菌溶解，是體液免疫的主要參與者[21]。酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，也是巨噬細(xì)胞內(nèi)最有代表性的水解酶。吞噬是巨噬細(xì)胞的典型功能之一，巨噬細(xì)胞吞噬異物顆粒形成吞噬體，然后用包括酸性磷酸酶在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒。酸性磷酸酶的活性代表著吞噬細(xì)胞清除異物的能力，即非特異性免疫能力[22]。堿性磷酸酶普遍存在于動植物體內(nèi)，是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶和解毒系統(tǒng)，在堿性條件下，可使磷酸單脂水解生成乙醇和磷酸，與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)[23]。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，可以清除體內(nèi)多余的自由基，其活性高低可以反映對蝦的抗應(yīng)激能力[24]。以上5種酶是對蝦重要的非特異性免疫酶，在對蝦體液免疫和抗病過程中發(fā)揮重要作用，其酶活力的高低常被用作評價對蝦免疫機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。

王娓等[4]報(bào)道，鮮活蠅蛆可顯著提高中國明對蝦酚氧化物酶活性；陳冰等[10]報(bào)道，在飼料中添加抗菌肽可提高凡納濱對蝦血清中酚氧化酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和溶菌酶活性；仲明等[15]用蠅蛆蟲肽蛋白粉飼養(yǎng)凡納濱對蝦，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力和殺菌活力隨著蟲肽蛋白粉用量增加而顯著增加；陳乃松等[25]和曹俊明等[6]報(bào)道用蠅蛆粉等氮替代魚粉飼養(yǎng)凡納濱對蝦，蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶或溶菌酶活性與對照差異不顯著，甚至低于對照組；劉麗波等[5]用鮮活蠅蛆等量替代人工配合飼料養(yǎng)殖凡納濱對蝦,發(fā)現(xiàn)不同替代組的酸性磷酸酶及堿性磷酸酶活性或與對照組差異不顯著或低于對照組。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦飼料中添加20%蠅蛆蛋白后，可顯著提高凡納濱對蝦血清中酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性，表明在基礎(chǔ)飼料中添加20%蠅蛆蛋白有助于提高凡納濱對蝦抗病力。該試驗(yàn)結(jié)果與王娓等[4，10，15]的結(jié)果一致，而與曹俊明等[6，25]不一致，推測蠅蛆粉不能提高免疫酶的活性可能與高溫干燥有關(guān)，而與劉麗波等[5]的結(jié)果不同，可能與其用鮮活蠅蛆等量替代人工配合飼料導(dǎo)致對蝦攝食的蛋白質(zhì)總量下降有關(guān)。

3.3 飼料中添加蠅蛆蛋白對凡納濱對蝦肌肉成分的影響

覃志彪等[27]在凡納濱對蝦飼料中添加抗菌肽可提高對蝦粗蛋白含量，降低粗脂肪含量，對水分與灰分含量無顯著影響；嚴(yán)晶等[28]采用等蛋白替代的方式，以家蠅蛆粉分別替代飼料中0、20%、40%、60%、80%和100%的魚粉飼養(yǎng)凡納濱對蝦，結(jié)果表明，凡納濱對蝦肌肉粗蛋白和灰分含量隨家蠅蛆粉替代水平的增加而升高，其中100%替代組的粗蛋白顯著高于對照組，灰分80%和100%替代組顯著高于對照組，粗脂肪和水分各組差異不顯著。本試驗(yàn)也證明，在飼料中添加蠅蛆蛋白可顯著提高對蝦粗蛋白含量，但對粗脂肪、灰分及水分影響不顯著。

肌肉氨基酸組成和含量是肌肉品質(zhì)研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容，肉質(zhì)的鮮美在一定程度上取決于呈味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)含量，其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的特征性氨基酸，甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的特征性氨基酸。肌肉中高含量的呈味氨基酸和必需氨基酸能提高魚肉風(fēng)味和肉質(zhì)[29]。鄭偉等[14]利用鮮蠅蛆養(yǎng)殖中國明對蝦，對蝦肌肉水解氨基酸的總量及其中的必需氨基酸、呈味氨基酸含量增加，必需脂肪酸含量顯著低于對照組，多不飽和脂肪酸則顯著高于對照組；嚴(yán)晶等[28]用家蠅粉等蛋白替代魚粉，養(yǎng)殖的凡納濱對蝦游離必需氨基酸除個別組外，其余各組均顯著高于對照組，總游離氨基酸也均高于對照組，各組結(jié)合氨基酸中的必需氨基酸差異不顯著，總氨基酸處理組均高于對照組，其中80%替代組與對照組差異顯著，呈鮮味氨基酸無論是游離或結(jié)合氨基酸均與對照組差異不顯著。本研究用添加蠅蛆蛋白的飼料養(yǎng)殖凡納濱對蝦，其肌肉氨基酸總量、必需氨基酸總量、呈味氨基酸總量以及必需氨基酸占總氨基酸的比值均顯著高于對照組；呈鮮味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在投喂蠅蛆蛋白的對蝦中含量顯著高于對照組，但呈甘味氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)則與對照組差異不顯著。本研究結(jié)果與鄭偉等[14]較一致，而與嚴(yán)晶等[28]不同，推測用鮮蠅蛆或本研究所使用的未變性蠅蛆蛋白，可能會更有效改善對蝦的品質(zhì)。試驗(yàn)證明，利用蠅蛆蛋白養(yǎng)殖凡納濱對蝦可有效提高蝦的營養(yǎng)價值，顯著增加蝦肉鮮味，該結(jié)果與蠅蛆蛋白在雞上的應(yīng)用效果相似[30]。

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