， ， ， [陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院骨科，重慶 400037]

鉛是一種在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的重金屬毒物，可對(duì)包括血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等各組織器官造成損傷[1]。有研究表明，骨骼同樣是鉛中毒的重要靶器官，鉛可對(duì)動(dòng)物成骨細(xì)胞功能造成損害，鉛中毒還可導(dǎo)致兒童血清中骨鈣素的水平下降[2]。成骨細(xì)胞是參與骨骼形成的主要細(xì)胞,對(duì)體內(nèi)骨組織生長(zhǎng)與發(fā)育、骨代謝的平衡以及損傷修復(fù)發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，成骨細(xì)胞過度凋亡，會(huì)影響骨骼修復(fù)，甚至進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、離子平衡以及對(duì)外界因素的應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用。因此，線粒體也是諸多外源性化合物最為敏感的靶點(diǎn)，尤其是在氧化損傷最主要的靶細(xì)胞器[5-7]。為研究鉛對(duì)成骨細(xì)胞損傷的作用與機(jī)制，本研究通過對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞染毒后培養(yǎng)，觀察并測(cè)定線粒體形態(tài)與功能變化，為揭示鉛對(duì)骨骼發(fā)揮毒性的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制

醋酸鉛[Pb(Ac)2，分析純]購(gòu)買于上?；瘜W(xué)試劑四廠，MC3T3-E1細(xì)胞株購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，BCA蛋白濃度試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)試劑盒、JC-1線粒體膜電位試劑盒、細(xì)胞色素c試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究所。CCK-8細(xì)胞增殖毒性試劑盒購(gòu)買于東仁化學(xué)科技公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買于Hyclone公司。胎牛血清購(gòu)買于Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞采用的DMEM培養(yǎng)基含體積分?jǐn)?shù)10%的FBS、100 ku/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，細(xì)胞培養(yǎng)箱參數(shù)為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試驗(yàn)分析細(xì)胞存活率 取生長(zhǎng)良好的MC3T3-E1細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔接種至96孔板中，分為對(duì)照組(Control組，不作任何處理)，醋酸鉛組(Pb組，加入醋酸鉛溶液，使培養(yǎng)液中醋酸鉛最終濃度分別為0、1、10、100 μmol/L)，每組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分組后，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，孵育1 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞提取液制備 取生長(zhǎng)良好的MC3T3-E1細(xì)胞按106個(gè)/瓶接種至100 mL培養(yǎng)瓶，分組與1.2.2項(xiàng)下相同，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液吸取備用。細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后收集至吸取的培養(yǎng)液中。經(jīng)過600 g 4 ℃ 5 min離心后收集細(xì)胞，去上清，用PBS洗滌1次，再去上清，按照100 μL裂解液每200萬細(xì)胞的比例加裂解液，經(jīng)重懸沉淀后，冰浴裂解15 min，經(jīng)4 ℃ 16 000～20 000 g 15 min離心后，吸取上清部分，BCA方法測(cè)得蛋白濃度后于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) 取生長(zhǎng)良好的MC3T3-E1細(xì)胞(細(xì)胞密度8×104個(gè)/mL)收集于6孔板中，培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，按照1.2.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行加藥。實(shí)驗(yàn)期滿后，加入JC-1探針，共同孵育20 min后用JC-1緩沖液洗滌2次。當(dāng)線粒體膜電位處于較高水平時(shí)，JC-1熒光探針主要聚集在線粒體的基質(zhì)當(dāng)中，形成聚合物，從而產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位處于較低水平時(shí)，JC-1熒光探針大部分不能聚集在基質(zhì)中，難以形成聚合物，因而JC-1單體產(chǎn)生綠色熒光。因此，可以使用TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡通過檢測(cè)紅色與綠色熒光比例的增減來反映線粒體膜電位的變化。具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.5 細(xì)胞ATP含量測(cè)定 ATP含量的測(cè)定通過ATP含量試劑盒(碧云天)完成，利用Tecan熒光酶標(biāo)儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.6 細(xì)胞色素c含量測(cè)定 首先通過細(xì)胞線粒體分離試劑盒(碧云天)分離出線粒體和漿蛋白。然后將線粒體和漿蛋白分別溶解于裂解緩沖液之中，用BCA方法分別測(cè)定對(duì)應(yīng)的蛋白濃度。利用ELISA試劑盒(碧云天)，分別檢測(cè)線粒體和漿蛋白中細(xì)胞色素c的含量，具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.7 Caspases-3活性檢測(cè) Caspases-3的活性通過Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒完成。與前述方法相同，先制備各組的細(xì)胞裂解液，并通過BCA方法測(cè)定對(duì)應(yīng)的蛋白濃度。催化底物Ac-DEVD-ρNA產(chǎn)生黃色的ρNA，之后用酶標(biāo)儀通過測(cè)量405 nm處的吸光度，反映Caspases-3的活性。

1.2.8 透射電鏡觀察線粒體形態(tài) 取生長(zhǎng)良好的MC3T3-E1細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于100 mL培養(yǎng)皿中，采用與1.2.2相同分組，細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別將細(xì)胞移入離心管中300 g離心5 min，棄上清，4 ℃預(yù)冷PBS漂洗1次。樣品經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色等步驟后通過透射電鏡觀察線粒體形態(tài)的改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鉛暴露對(duì)線粒體膜電位及ATP合成的影響

如圖1所示，MC3T3-E1細(xì)胞暴露于(0、1、10 μmol/L)醋酸鉛溶液24 h后，與對(duì)照組(Control)相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]線粒體膜電位去極化程度顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明線粒體膜電位降低，且體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；同樣，ATP含量測(cè)量顯示，與對(duì)照組相比，各暴露組[Pb(1)、Pb(10)、Pb(100)]的ATP合成顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著醋酸鉛濃度增高，ATP合成量下降更為顯著。本結(jié)果表明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細(xì)胞線粒體膜電位的降低，ATP合成減少。

a:JC-1探針標(biāo)記后，綠色熒光與紅色熒光的比例來反映線粒體膜電位去極化的程度(n=5)；b:利用ATP含量測(cè)定試劑盒(碧云天)進(jìn)行ATP含量測(cè)定(n=5) *:與對(duì)照組相比，P<0.05

圖1鉛暴露對(duì)線粒體膜電位及ATP合成的影響

2.2 鉛暴露對(duì)線粒體細(xì)胞色素c含量的影響

分離細(xì)胞胞漿和線粒體，分別檢測(cè)胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的含量。如圖2所示，MC3T3-E1細(xì)胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液24 h后，與對(duì)照組相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]的胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c從線粒體到胞漿的釋放增加。

a:胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c的含量(n=5)；b:線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的含量(n=5) *:與對(duì)照組相比，P<0.05

圖2鉛暴露對(duì)線粒體細(xì)胞色素c含量的影響

2.3 鉛暴露對(duì)線粒體形態(tài)及Caspase-3活性的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞暴露于100 μmol/L醋酸鉛溶液[Pb(100)]24 h后，與對(duì)照組相比，線粒體明顯腫脹，細(xì)胞核邊集，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，見圖3。

圖3 鉛暴露對(duì)細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

利用對(duì)應(yīng)試劑盒(碧云天)進(jìn)行Caspase-3活性測(cè)量結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液24 h后，與對(duì)照組相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]的Caspase-3活性顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，說明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細(xì)胞凋亡增加，且隨著劑量的增大，凋亡程度增加，見圖4。

*：與對(duì)照組相比，P<0.05

3 討論

鉛是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)與生活的的重金屬毒物，鉛暴露對(duì)骨骼的毒性一直以來沒有得到確切的證實(shí)。近年來，越來越多的研究顯示，骨骼也是鉛發(fā)揮其毒性作用的重要靶器官,鉛暴露可直接地或間接地改變骨骼各細(xì)胞功能[8-9]。目前，一般認(rèn)為細(xì)胞凋亡途徑主要包括線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)途徑、死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。有研究認(rèn)為，鉛可通過激活c-JUN氨基末端活化蛋白激酶(JNK)信號(hào)通路與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路誘導(dǎo)大鼠肝內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，也可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10-12]；鉛暴露可引起PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡機(jī)制可能與死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑有關(guān)；關(guān)于造血干細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞的研究則證明了醋酸鉛暴露可導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)與功能損傷，表明鉛具有明顯的線粒體毒性[13]。但在成骨細(xì)胞上，鉛暴露引起線粒體損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究鮮有報(bào)道。

線粒體作為細(xì)胞能量與代謝的中心，控制著細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈和氧化磷酸化，也在細(xì)胞凋亡與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮著重要的作用。許多關(guān)于細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的研究認(rèn)為，線粒體的結(jié)構(gòu)與功能障礙是多種刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵事件，線粒體內(nèi)的凋亡誘發(fā)因子因此釋放，從而對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控[14]。本研究通過研究MC3T3-E1細(xì)胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液后線粒體相關(guān)功能及細(xì)胞狀態(tài)的變化，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上證實(shí)了鉛暴露對(duì)成骨細(xì)胞的毒性。后續(xù)通過測(cè)量線粒體膜電位去極化程度與ATP合成量，胞漿與線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c含量以及Caspase-3活性，并結(jié)合透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)變化，探究了鉛對(duì)成骨細(xì)胞損傷的一種可能機(jī)制。

本研究通過線粒體膜電位與ATP合成量檢測(cè)證明了鉛暴露可致成骨細(xì)胞MC3T3-E1線粒體膜電位降低，ATP合成減少。線粒體作為細(xì)胞凋亡的控制中心，線粒體功能障礙可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。大量研究表明，線粒體膜的去極化是細(xì)胞凋亡早期的重要事件[15-16]。線粒體膜上的凋亡相關(guān)蛋白通過控制線粒體膜的通透性，從而可以調(diào)控線粒體內(nèi)的促凋亡因子如細(xì)胞色素c等的釋放，進(jìn)而可通過激活Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過測(cè)得胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c的含量顯著上升而線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的含量顯著下降，證明細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c從線粒體到胞漿的釋放增加。線粒體跨膜電位的去極化、ATP合成減少、線粒體腫脹及線粒體內(nèi)膜的嵴減少或消失都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞色素c以及相關(guān)凋亡因子從線粒體釋放至細(xì)胞漿，本研究的超微病理結(jié)果顯示，高濃度鉛暴露組線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，也進(jìn)一步證明了此結(jié)論。目前的研究普遍認(rèn)為，細(xì)胞色素c是線粒體在細(xì)胞凋亡過程中釋放的重要凋亡因子，線粒體釋放到膜外的細(xì)胞色素c，在ATP/dATP的參與下可以和Apaf-1結(jié)合，從而使Apaf-1的構(gòu)象發(fā)生改變，繼而使Apaf-1寡聚化[17]；Apaf-1氨基端和Caspase-9前體結(jié)合，可形成分子量為700～1 400 kD的“凋亡小體”，并在胞漿中的dATP的作用下進(jìn)一步使Caspase-9復(fù)合體發(fā)生自發(fā)激活?；罨蟮腃aspase-9能繼續(xù)激活作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行者的Caspase-3，Caspase-3進(jìn)而通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，裂解特異性底物從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡信號(hào)，介導(dǎo)執(zhí)行觸發(fā)細(xì)胞凋亡的多種因素。同時(shí)，Caspase-3與細(xì)胞凋亡時(shí)的一些特征標(biāo)志，如DNA的片段化以及染色體凝聚等，也有著直接的關(guān)系[18]。本研究中測(cè)得的Caspase-3活性結(jié)果也證實(shí)了暴露組線粒體損傷更為嚴(yán)重，細(xì)胞色素c釋放量更多，進(jìn)而Caspase-3活性更高，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程度更為嚴(yán)重。

綜上所述，本研究探究了鉛暴露導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的一種可能機(jī)制——鉛暴露可導(dǎo)致成骨細(xì)胞線粒體膜電位降低、ATP合成減少，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放量增加，Caspase-3活性增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 何剪太,朱軒儀,巫放明,等.鉛中毒和驅(qū)鉛藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2017,27(14):53-57.doi:10.3969/j.issn.1005-8982.2017.14.011.

[2] 郝稱莉,孟 靜,王 洋,等.鈣對(duì)染鉛大鼠骨骼損傷的保護(hù)機(jī)制[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,38(6):572-574.doi:10.3969/j.issn.0512-7955.2016.06.014.

[3] Chen X,Wang Z,Duan N,et al.Osteoblast-osteoclast interactions[J].Connect Tissue Res,2018,59(2):99-107.doi:10.1080/03008207.2017.1290085.

[4] 王秉義,潘 劍.丹參素拮抗氧化應(yīng)激所致骨質(zhì)疏松并通過PI3k/Akt通路減少成骨細(xì)胞的凋亡[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2017,23(1):1-5.doi:10.3969/j.issn.1006-7108.2017.01.001.

[5] Steiner JL,Lang CH.Etiology of alcoholic cardiomyopathy:mitochondria,oxidative stress and apoptosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2017,89:125-135.doi:10.1016/j.biocel.2017.06.009.

[6] Jong CJ,Ito T,Prentice H,et al.Role of mitochondria and endoplasmic reticulum in taurine-deficiency-mediated apoptosis[J].Nutrients,2017,9(8):E795.doi:10.3390/nu9080795.

[7] Iuliis GND,Baker MA,Jobling MS,et al.Oxidative stress and male reproductive health[J].Asian J Androl,2014,16(1):31-38.doi:10.4103/1008-682x.122203.

[8] Banijamali M,Rabbani-Chadegani A,Shahhoseini M.Lithium attenuates lead induced toxicity on mouse non-adherent bone marrow cells[J].J Trace Elem Med Biol,2016,36:7-15.doi:10.1016/j.jtemb.2016.03.008.

[9] Conti MI,Bozzini C,Facorro GB,et al.Lead bone toxicity in growing rats exposed to chronic intermittent hypoxia[J].Bull Environ Contam Toxicol,2012, 89(4):693-698.doi:10.1007/s00128-012-0753-1.

[10] Huang C,Lai C,Xu P,et al.Lead-induced oxidative stress and antioxidant response provide insight into the tolerance of phanerochaete chrysosporium to lead exposure[J].Chemosphere,2017,187:70-77.doi:10.1016/j.chemosphere.2017.08.104.

[11] Liu CM,Zheng GH,Ming QL,et al.Protective effect of quercetin on lead-induced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in rat liver via the IRE1/JNK and PI3K/Akt pathway[J].Free Radic Res,2013,47(3):192-201.doi:10.3109/10715762.2012.760198.

[12] 王超云,胡春卉,郭懷蘭.Fas/FasL信號(hào)通路在鉛暴露致PC12細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2017,17(2):114-117.doi:10.13604/j.cnki.46-1064/r.2017.02.02.

[13] Liu J,Jia DY,Cai SZ,et al.Mitochondria defects are involved in lead-acetate-induced adult hematopoietic stem cell decline[J].Toxicol Lett,2015,235(1):37-44.doi:10.1016/j.toxlet.2015.03.007.

[14] Xu F,Ren L,Song M,et al.Fas- and mitochondria-mediated signaling pathway involved in osteoblast apoptosis induced by AlCl3[J].Biol Trace Elem Res,2017.doi:10.1007/s12011-017-1176-y.

[15] 高健美,李海波.菟絲子通過線粒體通路抗叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡[J].中藥藥理與臨床,2014,30(5):89-92.doi:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.05.029.

[16] Schweikl H,Petzel C,Bolay C,et al.2-Hydroxyethyl methacrylate-induced apoptosis through the ATM- and p53-dependent intrinsic mitochondrial pathway[J].Biomaterials,2014,35(9):2890-2904.doi:10.1016/j.biomaterials.2013.12.044.

[17] Saikia M,Jobava R,Parisien M,et al.Angiogenin-cleaved tRNA halves interact with cytochrome c, protecting cells from apoptosis during osmotic stress[J].MolCell Biol,2014,34(13):2450-2463.doi:10.1128/mcb.00136-14.

[18] Wang X,Luo Y,Sun H,et al.Dynamic expression changes of Bcl-2,Caspase-3 and Hsp70 in middle cerebral artery occlusion rats[J].Brain Injury,2015,29(1):93-97.doi:10.3109/02699052.2014.945958.