，，， (延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院病理科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌異常的惡性腫瘤，占女性所有類(lèi)型惡性腫瘤的5%左右，在中國(guó)，每年約有20 000的惡性甲狀腺癌患者死亡[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是甲狀腺惡性腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤類(lèi)型，約占80%[3]。針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的治療目前主要采取手術(shù)聯(lián)合放療，但是治愈率不高[4]。探討新型腫瘤分子標(biāo)記物是目前急需解決的問(wèn)題。

目前研究指出參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展的最常見(jiàn)的遺傳改變包括RET-RAS-BRAF基因激、RET基因重排、BRAFV600E點(diǎn)突變及RAS突變等[5]。雖然這些遺傳改變會(huì)導(dǎo)致相同的信號(hào)通路的激活，但針對(duì)其具體機(jī)制作用的發(fā)揮目前不甚清楚。在人類(lèi)基因組中，每個(gè)miRNA可以控制多個(gè)基因靶標(biāo)，并且可以通過(guò)翻譯抑制調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)。關(guān)于基因表達(dá)模式的調(diào)節(jié)，miRNA類(lèi)似于直接調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子及其直接靶向于分子通路，負(fù)責(zé)特定的生物學(xué)現(xiàn)象。關(guān)于如何在甲狀腺癌中轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)miRNA的信息有限[6]，有研究通過(guò)結(jié)合核小體染色質(zhì)標(biāo)記以及DNA序列鑒定了175個(gè)miRNA的啟動(dòng)子區(qū)域，用于預(yù)測(cè)調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄因子，探討miRNA在不同惡性腫瘤類(lèi)型中的候選轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及生物學(xué)表達(dá)模式[7-8]。圓柱菌酶(cylindromatosis，CYLD)是卵巢腫瘤家族中的一種泛素-羧基末端水解酶，其由分解各種細(xì)胞蛋白質(zhì)中的賴氨酸酶連接多聚蛋白鏈組成[9]。CYLD在多種組織中均有表達(dá)，但其精確的生物學(xué)功能仍然不確定[10]。體外轉(zhuǎn)染研究結(jié)果表明，CYLD通過(guò)蛋白水解酶來(lái)降低NF-κB活性干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。但CYLD和miRNA之間的直接作用缺乏研究證據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究miR-181b和CYLD在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況及相互作用，抑制miR-181b表達(dá)后甲狀腺癌細(xì)胞株的增殖和凋亡行為的變化情況來(lái)推測(cè)miR-181b在甲狀腺癌中的表達(dá)模式，明確其對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的調(diào)控作用，為甲狀腺癌乳頭狀癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展過(guò)程的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料

收集2016年7月至2017年1月在我院手術(shù)切除并且經(jīng)病理檢查確診為甲狀腺癌患者30例的病變組織，同時(shí)取30例癌旁正常人的組織。離體后放入4%多聚甲醛中固定。人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株FTC-133、IHH-4、TPC-1和K1細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。miR-181b-inhibitor和陰性對(duì)照(NC)購(gòu)自中國(guó)上海GenePharma生物有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-181b-inhibitor和NC組模擬物購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因，TRIrizol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購(gòu)自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Kapa公司。

1.2 定量實(shí)時(shí)PCR分析

將細(xì)胞接種在12孔板中，生長(zhǎng)至50%融合以進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，90%用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA。在轉(zhuǎn)染后第3天，收獲細(xì)胞，并使用TRIZOL試劑提取總RNA。使用ImProm-II TM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)總RNA水平進(jìn)行qPCR分析。所有反應(yīng)用Step-One Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 蛋白質(zhì)印跡測(cè)定

使用RIPA緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，通過(guò)配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4 ℃下與一抗(濃度1∶1 000)一起孵育過(guò)夜。隨后，將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將NC組細(xì)胞和miR-181b-inhibitor組細(xì)胞分別以2×103濃度接種在6孔板中，在37 ℃孵箱孵育2周，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基，2周后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目，對(duì)比2組之間的差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡情況。將FTC-133細(xì)胞以2×105/孔的濃度接種在6孔板中，分別用NC和miR-181b-inhibitor轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，通過(guò)FITC標(biāo)記的AnnexinV/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-181b在甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

qPCR結(jié)果表明：與癌旁正常組織相比(圖1)，甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-181b表達(dá)水平明顯較高[(2.21±0.31)vs.(0.62±0.17)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-181b在FTC-133胞株中表達(dá)水平比IHH-4、K1、TPC-1細(xì)胞株明顯增高[(1.86±0.18)vs.(0.89±0.11)vs.(0.86±0.14)vs.(1.07±0.11),P<0.05](圖1)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，挑選FTC-133為進(jìn)一步生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

a:miR-181b在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達(dá)；b:miR-181b在不同甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株中的表達(dá)

圖1miR-181b的表達(dá)情況

2.2 miR-181b與CYLD之間的調(diào)控關(guān)系

通過(guò)Western blotting檢測(cè)miR-181b調(diào)控CYLD的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在miR-181b-ibhibitor組中CYLD的表達(dá)水平比NC組的明顯降低[(0.55±0.11)vs.(2.39±0.32)，P<0.05]，見(jiàn)圖2，表明抑制miR-181b的表達(dá)后，CYLD蛋白的激活水平相應(yīng)下調(diào)。

2.3 miR-181b調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖行為

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，miR-181b-inhibitor實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯低于NC對(duì)照組[(351.2±25.6)vs.(112.6±18.6)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制miR-181b的表達(dá)后，甲狀腺乳頭狀細(xì)胞FTC-133的增殖能力受到一定的抑制。

a:Western blotting檢查CYLD;b:Western blotting結(jié)果定量分析

圖2Westernblotting檢測(cè)miR-181b對(duì)CYLD蛋白表達(dá)的調(diào)控

a:對(duì)照組;b:miR-181b組;c:2組細(xì)胞數(shù)量定量分析

圖3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-181b對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 miR-181b調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌的凋亡行為

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，miR-181b-inhibitor實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡比率明顯高于NC對(duì)照組[(2.28±0.27)vs.(0.75±0.18)，P<0.05]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制miR-181b的表達(dá)后，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的凋亡行為得到一定程度的促進(jìn)。

a:對(duì)照組；b:miR-181b組

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-181b對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡行為的影響

3 討論

在不同甲狀腺腫瘤的組織病理學(xué)類(lèi)型具有不同的miRNA差異譜，反映了在miRNA在腫瘤中的特異性致癌突變[12]。從其發(fā)現(xiàn)的早期階段，已經(jīng)知道許多miRNA以組織特異性方式表達(dá)[13]。因此，研究miRNA在甲狀腺腫瘤之間的表達(dá)模式有重要的臨床意義。在甲狀腺乳頭狀癌中經(jīng)常觀察到miR-181b的表達(dá)異?，F(xiàn)象[14]。然而迄今為止，miR-181b和甲狀腺乳頭狀癌之間的關(guān)系尚未完全了解。本研究結(jié)果表明miR-181b在腫瘤性甲狀腺乳頭狀細(xì)胞中具有一定的致癌作用，作為CYLD蛋白的調(diào)節(jié)因子參與甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。事實(shí)上，據(jù)其他學(xué)者的相關(guān)報(bào)道指出，miR-181b在其他腫瘤中也可觀察到明顯的上調(diào)狀態(tài)，包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，前列腺癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系[15-17]。miR-181b可能有一定的腫瘤組織特異性和依賴性，其與基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)，在不同類(lèi)型的惡性腫瘤中可以靶向不同的下游蛋白種類(lèi)[18]。類(lèi)似地，CYLD蛋白在惡性腫瘤中具有相似的作用，在上皮衍生的腫瘤中作為調(diào)控因子發(fā)揮作用，并且可作為間質(zhì)源性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤啟動(dòng)子因子[19]。因此，miR-181b對(duì)CYLD蛋白的調(diào)控可能是甲狀腺乳頭狀癌中獨(dú)特的表達(dá)模式。

惡性腫瘤細(xì)胞的增殖潛力取決于調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞周期阻滯的能力。miR-181b與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)，而且可以通過(guò)調(diào)控CYLD的表達(dá)介導(dǎo)FTC-133細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，表明miR-181b具備一定的促細(xì)胞增殖的能力。miRNA分析的結(jié)果提供了更多的證據(jù)來(lái)支持腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的上調(diào)miRNA并且與常規(guī)腫瘤類(lèi)型不同，尤其是腺瘤和癌之間的表達(dá)差異。根據(jù)之前的相關(guān)研究，指出miRNA表達(dá)譜在特定腫瘤類(lèi)型中具有顯著的變異性[20]。本實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)表明，在這三種miRNA中，miR-181b在所有類(lèi)型的濾泡細(xì)胞衍生的甲狀腺腫瘤中以及甲狀腺增生性結(jié)節(jié)中都存在過(guò)表達(dá)狀態(tài)，且和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和凋亡行為直接相關(guān)。

總體而言，本實(shí)驗(yàn)觀察到甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤類(lèi)型和miR-181b表達(dá)之間的具有顯著相關(guān)性，與甲狀腺乳頭狀癌的表型特征及生物學(xué)特性相關(guān)。且miR-181b的表達(dá)和CYLD的表達(dá)之間的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但miR-181b的確可以影響甲狀腺乳頭狀癌的生長(zhǎng)和增殖，可能被用作臨床甲狀腺乳頭狀癌的治療和預(yù)后標(biāo)志物。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Vaccarella S,Franceschi S,Bray F,et al.Worldwide thyroid-cancer epidemic the increasing impact of overdiagnosis[J].New Engl J Med,2016,375(7):614-617.doi:10.1056/NEJMp1604412.

[2] Londero SC,Krogdahl A,Bastholt L,et al.Papillary thyroid microcarcinoma in Denmark 1996-2008:a national study of epidemiology and clinical significance[J].Thyroid,2013,23(9):1159-1164.doi:10.1089/thy.2012.0595.

[3] Rahib L,Smith BD,Aizenberg R,et al.Projecting cancer incidence and deaths to 2030:the unexpected burden of thyroid,liver,and pancreas cancers in the United States[J].Cancer Res,2014,74(11):2913-2921.doi:10.1158/0008-5472.

[4] Davies L,Morris LG,Haymart M,et al.American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology disease state clinical review:the increasing incidence of thyroid cancer[J].Endocrine Practice,2015,21(6):686-696.doi:10.4158/EP14466.DSCR.

[5] Seo JY,Kim EK,Baek JH,et al.Can ultrasound be as a surrogate marker for diagnosing a papillary thyroid cancer?Comparison with BRAF mutation analysis[J].Yonsei Med J,2014,55(4):871-878.doi:10.3349/ymj.

[6] Erler P,Keutgen XM,Crowley MJ,et al.Dicer expression and microRNA dysregulation associate with aggressive features in thyroid cancer[J].Surgery,2014,156(6):1342-1350.

[7] Haugen BR,Alexander EK,Bible KC,et al.2015 American Thyroid Association management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer:the American Thyroid Association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J].Thyroid,2016,26(1):1-133.doi:10.1089/thy.2009.0110.

[8] Graham MER,Hart RD,Douglas S,et al.Serum microRNA profiling to distinguish papillary thyroid cancer from benign thyroid masses[J].J Otolaryngol Head Neck Surg,2015,44(1):33.doi:10.1186/s40463-015-0083-5.

[9] Draber P,Kupka S,Reichert M,et al.LUBAC-recruited CYLD and A20 regulate gene activation and cell death by exerting opposing effects on linear ubiquitin in signaling complexes[J].Cell reports,2015,13(10):2258-2272.doi:10.1016/j.celrep.2015.11.009.

[10] Hrdinka M,Fiil BK,Zucca M,et al.CYLD limits Lys63-and Met1-linked ubiquitin at receptor complexes to regulate innate immune signaling[J].Cell reports,2016,14(12):2846-2858.doi:10.1016/j.celrep.2016.02.062.

[11] Zhao X,Jin B,Yang B,et al.Gadolinium chloride ameliorates acute lung injury associated with severe acute pancreatitis in rats by regulating CYLD/NF-κB signaling[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2017,492(2):255-261.doi:10.1016/j.bbrc.2017.08.061.

[12] Debette S,Verbaas CAI,Bressler J,et al.Genome-wide studies of verbal declarative memory in nondemented older people:the Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology consortium[J].Biological psychiatry,2015,77(8):749-763.doi:10.1016/j.biopsych.2014.08.027.

[13] Zhu C,Ren C,Han J,et al.A five-microRNA panel in plasma was identified as potential biomarker for early detection of gastric cancer[J].Bri J Cancer,2014,110(9):2291-2299.doi:10.1038/bjc.2014.119.

[14] Liu J,Shi W,Wu C,et al.miR-181b as a key regulator of the oncogenic process and its clinical implications in cancer[J].Biomedical reports,2014,2(1):7-11.doi:10.3892/br.2013.199.

[15] Sun Y,Wang J,Guo C,et al.MiR-181b sensitizes glioma cells to teniposide by targeting MDM2[J].BMC cancer,2014,14(1):611.doi:10.1186/1471-2407-14-611.

[16] Tao T,Liu C,Huang Y,et al.Mp55-15 involvement of Mir-181b-mediated ezh2/igf-1r signalling pathway in the growth and energy metabolism of prostate cancer[J].J Urol,2015,193(4):e678.doi:10.1016/j.juro.2015.02.2058.

[17] Strotbek M,Schmid S,Sánchez-González I,et al.miR-181 elevates Akt signaling by co-targeting PHLPP2 and INPP4B phosphatases in luminal breast cancer[J].Int J Cancer,2017,140(10):2310-2320.doi:10.1002/ijc.30661/full.

[18] Zheng Y,Lv X,Wang X,et al.miR-181b promotes chemoresistance in breast cancer by regulating bim expression[J].Oncology reports,2016,35(2):683-690.doi:10.3892/or.2015.4417.

[19] Xu D,Zhou P,Wang Y,et al.Reciprocal activation between STAT3 and miR-181b regulates the proliferation of esophageal cancer stem-like cells via the CYLD pathway[J].Molecular cancer,2016,15(1):40.doi:10.1186/s12943-016-0521-7.

[20] 涂超峰,肖 嵐,武明花,等.MiRNA基因及miRNA相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性與腫瘤易感性[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2014,33(6):520-524.doi:10.3969/j.issn.1673-2588.2013.06.014.