孫雪梅，趙才美，李友勇，程在全，尚衛(wèi)瓊，楊盛美，楊興榮，矣 兵，劉本英*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 勐海 666201；2. 云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666200；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223)

【研究意義】茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是多年生木本植物，在長(zhǎng)期的自然演化和人工選擇過(guò)程中，其遺傳背景復(fù)雜?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】云南屬于中國(guó)西南部，具有悠久的種茶歷史和獨(dú)特的氣候條件，孕育了豐富的茶樹(shù)資源，分布廣泛，類(lèi)型多樣(包括地方品種、選育品種、育成品種、野生種及近緣植物等)，被認(rèn)為是茶樹(shù)的原產(chǎn)地，是茶樹(shù)原始起源中心與物種多樣性中心。尤其地方品種和野生茶樹(shù)資源種類(lèi)較多，分布廣泛。地方品種與野生茶樹(shù)之間在物種類(lèi)型、形態(tài)特征、生化成分和基因水平均存在豐富的多樣性[1-3]。ISSR(inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)間序列)標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、快捷、可靠性好等特點(diǎn)，并已應(yīng)用許多作物遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳演化分析等[4]。目前，ISSR技術(shù)在茶樹(shù)資源上已有很多研究[5-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)云南茶樹(shù)地方品種與野生茶樹(shù)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從分子水平上探討它們之間的親緣關(guān)系，為更好地開(kāi)展茶樹(shù)資源的保護(hù)與利用、雜交親本的選配及茶樹(shù)的育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云南茶樹(shù)種質(zhì)資源67份(表1)，其中包括原產(chǎn)于云南保山品種10份，臨滄品種23份(含14份野生茶樹(shù))，德宏品種11份(含2份野生茶樹(shù))，西雙版納品種8份，大理品種2份，普洱品種13份，均采自于國(guó)家種質(zhì)勐海大葉茶樹(shù)資源圃。每份材料取4 ～6個(gè)一芽二葉新梢。

表1 67份云南茶樹(shù)資源的名稱(chēng)及來(lái)源Table 1 Name and origin of 67 tea Yunnan plants

注：以上材料均保存于國(guó)家種質(zhì)勐海大葉茶樹(shù)資源圃。

Note: The above germplasms were all stored in Menghai National Germplasm Tea Repositories.

1.2 基因組DNA提取

采用改良CTAB法[7]提取供試材料基因組DNA，并用滅菌ddH2O稀釋到50 ng/μl，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測(cè)

參照已有的茶樹(shù) ISSR- PCR 體系[8]，反應(yīng)體系總體積為15 μl，PCR組分如下：10×PCR buffer(含Mg2+)1.5 μl，10 nmol/L dNTP 0.3 μl， 5 UTaq酶0.2 μl，10 μmol/L引物0.5 μl，50 ng/μl 模板DNA 3 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR擴(kuò)增程序參照姚明哲方法[7]。PCR反應(yīng)在96孔熱循環(huán)儀(德國(guó)Biometra公司)上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物在1×TBE緩沖液中用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳1 h, 凝膠成像儀拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用人工讀帶方法，同一位置的條帶在各材料中有帶記1，無(wú)帶則記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。每2份材料間采用Nei公式[9]計(jì)算其遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)，GSij=2Nij/(Ni+Nj)，GDij=1-GSij，其中Nij指2份材料共有的帶數(shù)，Ni和Nj分別為i和j的擴(kuò)增總條帶數(shù)。使用Popgene_32軟件分析材料間的基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon指數(shù)(Shannon index，I)和組間進(jìn)化樹(shù)等。使用軟件NTSYS-pc version 2.1[10]進(jìn)行聚類(lèi)與主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記多態(tài)性

隨機(jī)選取10份材料從42條ISSR引物中初步篩選出25條引物分別對(duì)全部材料進(jìn)行擴(kuò)增，最終篩選出23條引物擴(kuò)增效果良好(表2)，占所合成引物的54.7 %，圖1為引物UBC848的擴(kuò)增結(jié)果。使用23條引物對(duì)67份材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)從5～13不等，23條引物共擴(kuò)增出223個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)218個(gè)，占總條帶數(shù)97.76 %，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)9.5個(gè)，平均基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)，分別為0.27和0.42(表2)。

M為2000 bp DNA ladder分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1～67分別為表1中的供試材料編號(hào)M：2000 bp DNA ladder marker; 1-67：No. of the tea accessions in the table 1圖1 引物UBC848的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplication of primer UBC848

表2 引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性Table 2 Amplification result and polymorphism of primers

2.2 供試材料的遺傳相似程度

使用軟件NTSYS-pc version 2.1分析67份茶葉種質(zhì)資源矩陣數(shù)據(jù)，計(jì)算出種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)(表3)。它們之間的遺傳相似系數(shù)變化在0.659～0.736，平均為0.693。普洱地方品種的平均遺傳相似系數(shù)最高(0.736)，表明其遺傳多樣性較低；而德宏野生茶樹(shù)的平均遺傳相似系數(shù)最低(0.659)，表明其遺傳多樣性相對(duì)較高。從不同茶樹(shù)種質(zhì)的來(lái)源及類(lèi)型上看，保山地方品種與臨滄鳳慶野生茶樹(shù)的遺傳相似程度最低，其次是臨滄地方品種與其野生茶樹(shù)，說(shuō)明地方品種與野生茶樹(shù)之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而普洱地方品種與德宏地方品種和大理地方品種的遺傳程度高，其次是保山地方品種與德宏地方品種，說(shuō)明來(lái)源不同的云南地方品種之間親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性也相對(duì)較低。

2.3 供試材料的聚類(lèi)分析

根據(jù)算出的遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA法對(duì)供試67份茶樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)。在遺傳相似系數(shù)0.666處(細(xì)線(xiàn)處)，可將供試材料分為兩大類(lèi)：第I類(lèi)55份品種，包括全部的地方品種和4份野生茶樹(shù)(弄島野茶、00477野生古茶樹(shù)、00472號(hào)野生古茶樹(shù)和00426野生古茶樹(shù))，第II類(lèi)為12份野生茶樹(shù)；進(jìn)一步劃分(遺傳相似系數(shù)0.666處)可將第I類(lèi)組內(nèi)分為3個(gè)亞組，第I 1亞組包括4份品種，為保山地方品種，第I 2亞組49份，其中47份為地方品種，而2份品種(弄島野茶和00477野生古茶樹(shù))為野生茶樹(shù)，第I 3亞組2份，分別為00472號(hào)和00426號(hào)野生茶樹(shù)。第II類(lèi)組內(nèi)可分為2個(gè)亞組，第II 1亞組為瑞麗野茶單獨(dú)聚為一類(lèi)，第II 2亞組11份，均為野生茶樹(shù)。從圖2聚類(lèi)關(guān)系圖結(jié)果顯示，來(lái)源于云南不同地方的茶樹(shù)品種和多數(shù)野生茶樹(shù)各自聚為一類(lèi)，說(shuō)明這些茶樹(shù)品種的地理來(lái)源與遺傳差異之間并沒(méi)有明顯的差異，而與其品種類(lèi)型有一定關(guān)系，這與傳統(tǒng)分類(lèi)一致。

表3 不同來(lái)源茶樹(shù)地方品種和野生品種的平均遺傳相似系數(shù)Table 3 Average genetic similarity coefficient of different local varieties and wild species in tea

材料編號(hào)同表1 Material number was the same as table 1圖2 67份茶樹(shù)種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析Fig.2 Dendrogram of 67 tea germplasm resources using UPGMA based on ISSR analysis

2.4 主成分分析

基于ISSR原始矩陣，利用NTSYS-pc version 2.1軟件進(jìn)行主成分分析(圖3)，位置相近者說(shuō)明關(guān)系近，位置遠(yuǎn)離者則關(guān)系遠(yuǎn)。比較圖2～3，主成分分析的結(jié)果與系統(tǒng)聚類(lèi)的結(jié)果基本一致，其比聚類(lèi)分析更直觀地顯示各個(gè)供試材料之間的親緣關(guān)系。

3 討 論

ISSR標(biāo)記能夠靈敏地揭示品種(系)間的差異，同時(shí)該技術(shù)所要求的引物較長(zhǎng)(16～25 bp)，退火溫度較高，可重復(fù)性高[11]。吳清韓等[12]對(duì)48份鳳凰單叢茶樹(shù)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，多態(tài)位點(diǎn)比率為 81.0 %。Liu等[13]利用ISSR標(biāo)記分析134份云南茶樹(shù)資源，多態(tài)性比例高達(dá)98.9 %。本研究用23條引物對(duì)67份云南茶樹(shù)資源進(jìn)行多樣性分析，擴(kuò)增出223個(gè)條帶，218個(gè)條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為97.76 %，這些多態(tài)性主要是由于品種間的差異造成的，可以有效地反映品種間的親緣關(guān)系。

圖3 67份茶樹(shù)種質(zhì)資源的主成分分析Fig.3 Principle component analysis of 67 tea germplasm resources

遺傳相似系數(shù)是用來(lái)比較不同品種或群體間遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究中，各品種間的相似系數(shù)變化在0.659～0.736，平均值為0.693，略高于姚明哲等[14]對(duì)36個(gè)無(wú)性系茶樹(shù)品種和劉本英等[13]對(duì)134份云南茶樹(shù)資源的研究結(jié)果，多數(shù)地方品種間的遺傳相似系數(shù)高于野生資源的遺傳相似系數(shù)，原因在于茶樹(shù)是異花授粉植物，本身是雜合體，而云南茶樹(shù)地方品種多數(shù)是大葉茶樹(shù)資源，相互間可能存在基因交流的現(xiàn)象，導(dǎo)致地方品種間的遺傳距離小、遺傳多樣性有降低趨勢(shì)。周炎花等[15]對(duì)51份廣西茶樹(shù)地方品種的遺傳多樣性表明來(lái)自廣西不同地區(qū)地方品種間的遺傳多樣性較低，本研究結(jié)果與其基本相一致。而云南野生資源遺傳背景較復(fù)雜，根據(jù)周萌等[16]對(duì)100份云南野生茶樹(shù)資源的遺傳多樣性分析，研究結(jié)果表明云南野生茶樹(shù)的遺傳多樣性豐富。本研究由于客觀條件等原因，所使用的野生茶樹(shù)來(lái)源和數(shù)量較少，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可能有一定影響，但是多數(shù)野生茶樹(shù)的遺傳多樣性比地方品種遺傳多樣性高，只有極少部分野生茶樹(shù)的遺傳相似系數(shù)略高于地方品種，可能與其復(fù)雜的遺傳背景和農(nóng)藝性狀有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果表明，來(lái)源不同的云南地方品種和少數(shù)野生茶樹(shù)因地理來(lái)源相近和遺傳背景相似而聚在同一類(lèi)群中，而多數(shù)野生茶樹(shù)由于遺傳背景相對(duì)于其他品種較遠(yuǎn)聚在單獨(dú)的一類(lèi)。說(shuō)明云南地方品種間的親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)單一，其中少數(shù)野生茶樹(shù)與地方品種聚為一類(lèi)，它們可能與地方品種有著直接或間接的親緣關(guān)系，具有相近的遺傳背景。通過(guò)對(duì)云南地方品種與野生茶樹(shù)遺傳多樣性的研究，可以為今后在充分利用地方品種的同時(shí)，要著重引入野生茶樹(shù)或其他省份茶樹(shù)的外源遺傳變異，增加茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，培育和選育出優(yōu)良的茶樹(shù)新品種。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣會(huì)兵, 宋維希, 李友勇, 等. 云南茶樹(shù)種質(zhì)資源的表型遺傳多樣性[J]. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39(11):2000-2008.

[2]陳 亮, 王平盛, 山口聰. 應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記鑒定野生茶樹(shù)種質(zhì)資源研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 22(1): 19-24.

[3]馬 玲, 蔣會(huì)兵, 何青元, 等. 云南文山古茶樹(shù)資源調(diào)查和分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 30(8):1732-1738.

[4]Femamdez M E, Figueiras A M, Benito C. The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism, genetype identification and diversity among barley cultivars with known origin[J]. Theor Appl Genet, 2002, 104:845-851.

[5]譚和平, 徐利遠(yuǎn), 余桂蓉, 等. 茶樹(shù)種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記初步研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 20(2):113-115.

[6]姚明哲, 陳 亮, 王新超, 等. 我國(guó)茶樹(shù)無(wú)性系品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(4):598-604.

[7]劉本英, 王平盛, 周紅杰, 等. 云南茶樹(shù)ISSR-PCR技術(shù)體系的建立[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 21(增刊) :21-25.

[8]姚明哲, 王新超, 陳 亮, 等. 茶樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 茶葉科學(xué), 2004, 24(3):172-176.

[9]Nei M, Li W. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1979, 76:5269-5273.

[10]Rohlf F J. Statistical power comparisons among alternative morphometric methods[J]. Am J Phys Anthropol, 2000, 111: 463-478.

[11]胡邵慶, 邱英雄, 洪光洪, 等. 桂花品種的ISSR分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 28:71-75.

[12]吳清韓, 莊東紅, 朱 慧, 等. 鳳凰單叢茶樹(shù)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2015, 36(3):499-503.

[13]劉本英, 李友勇, 唐一春, 等. 云南茶樹(shù)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2010, 36(3): 391-400.

[14]姚明哲, 陳 亮, 王新超, 等. 我國(guó)茶樹(shù)無(wú)性系品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2007,33(4): 598-604.

[15]周炎花, 喬小燕, 馬春雷, 等. 廣西茶樹(shù)地方品種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的EST-SSR分析 [J]. 林業(yè)科學(xué), 2011, 47(3):59- 67.

[16]周 萌, 李友勇, 孫雪梅, 等. 基于EST-SSR標(biāo)記的云南野生茶樹(shù)遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013, 41(12):22-27.