周評平，李治華，董 玲，趙 馳，朱永清*(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院，四川 成都 610066；.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】郫縣豆瓣醬是川菜重要的調(diào)味品，被譽為“川菜之魂”[1]。蠶豆是生產(chǎn)郫縣豆瓣醬的重要原料之一，蠶豆瓣醅的質(zhì)量好壞直接影響著郫縣豆瓣的品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M展】目前國內(nèi)外學者對黃豆醬醅的微生物多樣性研究較多，但是對蠶豆醬醅的微生物多樣性研究較少?！颈狙芯壳腥朦c】長期以來，人們對發(fā)酵食品微生物菌落的研究主要采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)方法，免培養(yǎng)方法相對于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法有很多優(yōu)勢，更能全面揭示微生物多樣性和深入了解微生物群落及其功能[2]。隨著測序費用的降低和生物信息學的發(fā)展,利用denovo測序方法研究微生物菌落多樣性已成為一個重要手段。過去采用16S、ITS等擴增子測序分析的準確度有限，往往只能到屬，而denovo測序可以彌補上述不足，可以準確到種甚至菌株水平[3]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以郫縣豆瓣制作中蠶豆瓣醅為研究對象，采用denovo測序的結(jié)果分析其微生物多樣性。不僅為后續(xù)深入研究其發(fā)酵過程微生物功能提供了技術(shù)支撐，而且對郫縣豆瓣微生物安全性評價提供了有效的方法。

表1 質(zhì)控統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Statistic data for quality control

1 材料與方法

1.1 宏基因組DNA提取材料

傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的蠶豆瓣醬醅。樣品采集后放在冰上立即運回實驗室分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 DNA提取采用方法參考李治華等[4]，取10 g蠶豆瓣醬醅到90 mL生理鹽水，充分振蕩洗脫出樣品中的微生物，用無菌金屬網(wǎng)過濾，取濾液在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，按照上海生工試劑盒(Ezup Column Soil DNA Purification Kit)使用說明提取菌體DNA。

1.2.2 宏基因組DNA檢測 提取DNA在1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，2 μl上樣，觀察DNA質(zhì)量。用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測DNA純度和濃度 (NanoDrop Technologies, Del., U.S.A.)。

1.2.3 文庫構(gòu)建和測序 使用 NEBNext?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行文庫構(gòu)建。

使用Illumina HiSeq平臺進行測序，測序長度2×150 bp。測序得到的原始二進制basecalling數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina bcl2fastq軟件轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)Raw data，結(jié)果以 fastq 文件格式存儲。測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計使用Illumina RTA軟件進行圖像識別和Basecalling，Illumina bcl2fastq 2.17根據(jù)每個樣本的index信息進行demultiplexing并統(tǒng)計產(chǎn)出reads數(shù)和堿基測序質(zhì)量(Q30)，質(zhì)控統(tǒng)計結(jié)果見表1。

M:1kb DNA ladder, 1為樣本(2 μl)，2位空白對照M:1kb DNA ladder, 1: Test sample(2 μl)，2:Control sample圖1 宏基因組DNA提取結(jié)果Fig.1 Metagenomic DNA extraction

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析方法采用 Sunagawa 等2013年發(fā)表在《Nature methods》的mOTUs方法[3]和Senavirathne 等2015年發(fā)表在《Nature methods 》的Metaphlan2方法[5]

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組DNA提取

電泳檢測如圖1，樣品條帶明亮。Nanodrop2000分析核酸濃度為73.5 ng/μl， 核酸質(zhì)量為3.3 μg，A260/280=1.74，A260/230=0.47。電泳和Nanodrop2000分析顯示樣品滿足建庫要求，且總量可以滿足2次或者2次以上建庫需要的樣品。

2.2 測序結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

mOTUs方法發(fā)現(xiàn)共有12個種的微生物相對豐度大于1.00 %，Metaphlan2方法發(fā)現(xiàn)共有11個種的微生物相對豐度大于1.00 %，其中嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)被2種方法同時確定為優(yōu)勢菌種， mOTUs方法顯示其相對豐度為64.26 %，Metaphlan2分析其豐度為50.80 %， Metaphlan2進一步分析得出其菌株為NBRC 12172，是醬油和魚醬的一個重要耐鹽菌株[6]。破布子乳酸菌(Lactobacilluspobuzihii)僅僅被Metaphlan2分析到，而且其相對豐度為17.60 %，但沒有被mOTUs方法分析出，具體菌株為E100301，首次是在臺灣的傳統(tǒng)發(fā)酵食品破布子中分離得到[7]。約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)2種方法顯示其豐度分別為4.43 %和4.17 %，但是具體菌株無法在NCBI數(shù)據(jù)庫比配，暗示有可能是一株新的菌株。

在mOTUs相對豐度大于1.00 %的菌群里，Metaphlan2揭示到菌株水平的還有3株，分別為溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)，菌株為JCSC5402，有報道該菌株對甲氧西林(methicillin)具有抗性，在進化上與金黃色葡萄球菌高度相關(guān)[8]；腸桿菌屬種暫定編號638(Enterobactersp. 638)，因與目前該種下的菌株有明顯區(qū)別，菌株暫定為638；類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)，菌株為ATCC 33313，是一株典型的乳酸菌。除此以外，都不能被確定到菌株水平(unclassified)，暗示蠶豆瓣醬醅里存在較多未被認識的微生物資源，對這些菌株的進一步分離有利于揭示蠶豆瓣醬醅的微生態(tài)基礎(chǔ)。另外，融合魏斯氏乳酸菌(Weissellaconfusa)，菌株為LBAE C39-2，僅僅被Metaphlan2檢測到。

表2 mOTUs和 Metaphlan2分析蠶豆瓣醬醅微生物多樣性Table 2 Analysis of microbial diversity in doubanjiang-meju using mOTUs and Metaphlan2 methods, respectively

注：“nd”表示沒有被檢測到；“-”表示 Metaphlan2方法在NCBI數(shù)據(jù)庫里沒有對應(yīng)的菌株；對應(yīng)菌株NCBI查詢編號;“ unclassified”表示沒有對應(yīng)編號。

3 討 論

3.1 de novo測序與擴增子測序

相比擴增子測序，denovo測序精確到了種水平，而且一次測序同時可以分析真菌和細菌，避免擴增子的2對引物，多次PCR過程產(chǎn)生的偏差[9]。

3.2 mOTU方法和Metaphlan2方法比較

2種方法結(jié)果較高程度的吻合，可以相互印證，Metaphlan2更進一步分析到了菌株級別。

3.3 蠶豆瓣醬醅的優(yōu)勢微生物

嗜鹽四聯(lián)球菌(T.halophilus)是蠶豆瓣醬醅的優(yōu)勢微生物，相對豐度占一半以上(mOTUs方法為64.26 %，Metaphlan2方法為50.80 %)，Metaphlan2方法發(fā)現(xiàn)破布子乳酸菌(L.pobuzihii)也是優(yōu)勢菌株，其相對豐度為17.60 %，這與作者先前報道的一致[9]。另外，大量未分離到的微生物有待進一步研究。

4 結(jié) 論

denovo全基因組測序能分析到蠶豆瓣醅微生物中種或菌株的水平，研究結(jié)果不僅為后續(xù)深入研究提供了技術(shù)支撐，而且對郫縣豆瓣的微生物安全性評價提供了有效的方法。

參考文獻：

[1]李幼筠. “郫縣豆瓣”剖析[J]．中國釀造，2008，11:83-86.

[2]李 昂，崔 迪，王繼華，等. 適用于第2代測序技術(shù)的宏基因組DNA 提取方法[J]. 哈爾濱工業(yè)大學學報，2012(6)：20-23.

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[7]Chen Y S, Miyashita M, Suzuki K, et al.Lactobacilluspobuzihiisp. nov., isolated from pobuzihi (fermented cummingcordia)[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60(8): 1914-1917.

[8]Baba T, Kuwahara-Arai K, Uchiyama I, et al. Complete genome sequence of Macrococcus caseolyticus strain JSCS5402, reflecting the ancestral genome of the human-pathogenic staphylococci[J]. Journal of Bacteriology, 2009, 191(4): 1180-1190.

[9]Li Z, Rui J, Li X, et al. Bacterial community succession and metabolite changes during doubanjiang-meju fermentation, a Chinese traditional fermented broad bean (ViciafabaL.) paste[J]. Food Chemistry, 2017, 218: 534-542.