張曉松，吳明亮，金花

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是引起機(jī)體衰老、癌變和其他多種疾病的主要起因之一[1]?？寡趸瘎┯欣跍p少自由基的產(chǎn)生或加速其清除，可對(duì)抗由自由基產(chǎn)生的副作用，對(duì)健康非常有益[2]。目前，人們已從多種植物和動(dòng)物組織中提取出效果優(yōu)良的天然抗氧化劑，并且已應(yīng)用于各種食品加工工業(yè)中[3－4]。研究表明，大豆蛋白經(jīng)酶水解后，其產(chǎn)物大豆肽的抗氧化、降血壓、提高免疫力的能力均會(huì)有效增強(qiáng)[5]。此外，β－伴大豆球蛋白還是一種糖蛋白，這使得β－伴大豆球蛋白的營(yíng)養(yǎng)和生理功能有異于單純的多肽，能夠在生物體中發(fā)揮著十分重要的作用[4]。因此，關(guān)于β－伴大豆球蛋白酶解物的生物活性研究，對(duì)充分利用大豆蛋白資源具有重要意義。

超聲波是高于人類(lèi)聽(tīng)覺(jué)閾值頻率（＞16 kHz）的機(jī)械波，可用于食品物理或化學(xué)性質(zhì)的改變，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注[6－7]。Hu等[8]研究發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理能明顯降低大豆分離蛋白分散體的稠度系數(shù)，增加大豆分離蛋白流變性能和微觀結(jié)構(gòu)的聚集。Jiang等[9]發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理可破壞黑豆蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使蛋白分子伸展，改善黑豆蛋白的功能特性。Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理可提高高變性豆粕酶解物的抗氧化活性。目前許多研究已經(jīng)報(bào)道了超聲預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，但是以β－伴大豆球蛋白為研究對(duì)象，研究超聲預(yù)處理前后β－伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)的變化，探討其對(duì)酶解物抗氧化活性改變的影響機(jī)理的報(bào)道較少。

因此，本文旨在研究超聲預(yù)處理對(duì)β－伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)及其酶解物抗氧化活性的影響，并通過(guò)比較超聲預(yù)處理前后β－伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)的變化，探討超聲預(yù)處理提高β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性的機(jī)理。本研究對(duì)提高β－伴大豆球蛋白酶解效率，改善β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性，為提高大豆蛋白資源利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕[蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（50.5± 0.6）%，干基]：哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（酶活力為2.0×105U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉（dodecyl sulfate，SDS）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品、8－苯胺基－1－萘磺酸（8－anilino－1－naphthalenesulfonic acid，ANS）：美國(guó) Sigma 公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

凱氏定氮儀（K9840）：濟(jì)南海能儀器有限公司；電泳系統(tǒng)（Mini－protean IV）：美國(guó) Bio－Rad 公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92－2D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU－1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；拉曼光譜儀（Raman Station 400）：美國(guó)PerkinElmer公司；熒光分光光度計(jì)（F－4500）：日本 Hitachi公司；自動(dòng)電位滴定儀（TIM840）：美國(guó)Radiometer公司；冷凍干燥機(jī)（FD5－3）：美國(guó) SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 β－伴大豆球蛋白的制備

采用優(yōu)化Nagano法[11]分離提取β－伴大豆球蛋白，其具體流程見(jiàn)圖1。

圖1 β-伴大豆球蛋白制備流程圖Fig.1 Process diagram of β-conglycinin in the process of preparation

1.3.2 β－伴大豆球蛋白的表征

采用不連續(xù)SDS－PAGE電泳方法[12]，分別配置5%的分離膠與12%的濃縮膠，上樣量為10 μL。初始電泳電壓為80 V，當(dāng)樣品達(dá)到分離膠后電壓改為120 V，結(jié)束后取出膠片用考馬斯亮藍(lán)R－250染色，然后用甲醇/冰醋酸脫色，對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。采用BandScan 5.0軟件對(duì)SDS－PAGE譜帶進(jìn)行分析，β－伴大豆球蛋白純度達(dá)到82.9%。

1.3.3 超聲預(yù)處理

參照Hu等[13]方法，略有改動(dòng)。將β－伴大豆球蛋白與蒸餾水以3 g：100 mL的比例混合于100 mL錐形瓶中，室溫下不斷攪拌1 h，然后將超聲波處理器的鈦探頭（直徑=0.6 cm）插入液面下，距離錐形瓶底部1 cm處，在20 kHz下進(jìn)行超聲預(yù)處理。改變不同超聲功率（100、300、500 W），超聲時(shí)間（10、30、50min）和超聲溫度（40、50、60℃），具體條件見(jiàn)表1，并研究各條件參數(shù)對(duì)β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性的影響。經(jīng)超聲處理后，樣品在－40℃預(yù)凍24 h，然后把預(yù)凍樣品放入冷凍干燥機(jī)中冷凍，直至樣品完全干燥。將凍干樣品密封于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 β-伴大豆球蛋白超聲預(yù)處理方式Table 1 Ultrasound pretreatment parameters of β-conglycinin

1.3.4 紫外光譜的測(cè)定

參照涂宗財(cái)?shù)鹊姆椒╗14]，稱(chēng)取一定量的蛋白樣品，溶于 0.01 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）中，采用 Lowry法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)含量，將待測(cè)液的蛋白濃度稀釋至0.2 mg/mL，用于紫外光譜分析。波長(zhǎng)范圍為220 nm～360 nm，分辨率為0.2 nm，掃描速率為50 nm/min。

1.3.5 拉曼光譜的測(cè)定

參照Wong等的方法[15]，將蛋白樣品直接平鋪在載玻片上進(jìn)行拉曼光譜測(cè)定。在室溫下，測(cè)量方式如下：激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，激發(fā)功率為40 mW/cm，分辨率掃描范圍為400 cm－1～2 000 cm－1，掃描次數(shù)為3 次以上，通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)信號(hào)累加平均輸出樣品的拉曼光譜圖，峰位誤差小于±3 cm－1。利用 Origin 8.0 軟件對(duì)拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理，校正基線后采用苯丙氨酸（1 003±1）cm－1作為歸一化因子，以此作為各拉曼峰強(qiáng)度變化的依據(jù)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的定量分析采用Peakfit 4.12軟件進(jìn)行擬合。

1.3.6 表面疏水性（H0）的測(cè)定

參照Alizadeh等的方法[16]，測(cè)定蛋白樣品的表面疏水性。稱(chēng)取25 mg樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）中，在室溫條件下磁力攪拌 30min，4 000 r/min離心20min，取上清液備用。上清液被磷酸鹽緩沖溶液稀釋成蛋白濃度為0.005 mol/mL到0.5 mol/mL的溶液，取上述濃度范圍的蛋白樣品溶液4 mL，加入濃度為8 mmol/L的 ANS溶液 40 μL，充分振蕩后，靜置3min，測(cè)定蛋白樣品的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，夾縫為5 nm。蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（H0）通過(guò)作圖法求得，采用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率為表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.7 β－伴大豆球蛋白的酶解工藝

稱(chēng)取一定量的β－伴大豆球蛋白配成底物濃度為3%的溶液，采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解[17]，加酶量24 000 U/g底物，pH 9.0，溫度 45℃、酶解時(shí)間 4 h，加入 1.00 mol/L 的 NaOH，使系統(tǒng)保持在 pH 9.0。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶活10min。冷卻，添加1.00 mol/LHCl調(diào)pH至4.3，4 000 r/min離心15min。收集上清液，冷凍干燥，將凍干樣品于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 羥自由基清除率的測(cè)定

參照Amarowicz等的方法[18]，略有改動(dòng)。取1.00 mL酶解液樣品加入1.00 mLFeSO4（3 mmol/L）和1.00 mL H2O2（3 mmol/L），置于暗處反應(yīng)10min，再加入1.00 mL水楊酸乙醇溶液（3 mmol/L），置于暗處反應(yīng)30min，在510 nm處測(cè)定吸光度。

按照以下公式計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率/%=[1－（Ai－Aj）/A0]×100

式中：Ai為加入 1.00 mL 樣品、1.00 mL FeSO4和1.00 mL H2O2、1.00 mL 水楊酸乙醇溶液時(shí)測(cè)定的吸光度；Aj為以1.00 mL超純水代替水楊酸乙醇溶液時(shí)測(cè)定的吸光度；A0為以1.00 mL超純水代替樣品時(shí)測(cè)定的吸光度。

1.3.9 還原能力的測(cè)定

參照Yu等[19]的方法測(cè)定還原能力。取1 mL酶解液樣品加入 0.2 mol/L pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液 2.50 mL和 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）K3Fe（CN）6溶液 2.50 mL，搖勻，50℃保溫20min，冰水浴迅速冷卻。加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液2.5mL，3 500 r/min 離心 10min。取 2.5mL上清液，加 2.5 mL 超純水和 0.5 mL 0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鐵溶液，混勻靜置10min。以超純水代替樣品調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度與樣品還原能力成正相關(guān)。

1.3.10 Fe2+螯合能力的測(cè)定

參照Amarowicz等的方法測(cè)定Fe2+螯合能力。取1 mL酶解液樣品加入3.7mL超純水和0.1mL20mmol/L FeCl2，靜置 3min，加入 0.2 mL 5 mmol/L 菲洛嗪混合10min，在562 nm處測(cè)定吸光度。

以螯合能力（%）表示，計(jì)算公式為：

螯合能力/%=（1－Ai/A0）×100

式中：Ai為1 mL 樣品加入 3.7 mL 超純水和 0.1 mL FeCl2和0.2 mL菲洛嗪時(shí)測(cè)定的吸光度；A0為以1 mL超純水代替1 mL樣品后測(cè)定的吸光度。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有結(jié)果均表示為平均數(shù)±s，每個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次。采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，p ＜0.05 為差異顯著。采用 Origin8.5 軟件、PeakFit 4.12軟件等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)β－伴大豆球蛋白紫外光譜影響的分析

蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸和苯丙氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光有吸收作用，不同的氨基酸有不同的生色基團(tuán)。其中，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280 nm附近，苯丙氨酸的紫外吸收峰在257 nm附近。因此，紫外光譜可用來(lái)研究蛋白質(zhì)側(cè)鏈的變化，探討超聲預(yù)處理對(duì)β－伴大豆球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。根據(jù)蛋白質(zhì)對(duì)紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質(zhì)分子在溶液中構(gòu)象的變化[20]。

超聲預(yù)處理對(duì)β－伴大豆球蛋白紫外光譜的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件β-伴大豆球蛋白的紫外光譜Fig.2 UV spectra of β-conglycinin with different ultrasoundtreated

從圖2可以看出，β－伴大豆球蛋白溶液經(jīng)不同超聲功率、時(shí)間、溫度預(yù)處理后，峰位沒(méi)有位移，峰型無(wú)明顯區(qū)別。但相比未超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）樣品，超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白在280 nm附近的吸收峰都有所增強(qiáng)，說(shuō)明超聲預(yù)處理可增加β－伴大豆球蛋白的紫外吸收。這可能是由于超聲波的機(jī)械作用力破壞了致密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致超聲預(yù)處理后β－伴大豆球蛋白側(cè)鏈發(fā)生了變化。與未處理的β－伴大豆球蛋白溶液相比，超聲預(yù)處理后的β－伴大豆球蛋白溶液中，增加了具有紫外吸收的芳香族氨基酸殘基，如酪氨酸、色氨酸殘基等，提高了蛋白樣品在紫外光譜中吸收峰的強(qiáng)度[21]。

2.2 超聲預(yù)處理對(duì)β－伴大豆球蛋白拉曼光譜影響的分析

拉曼光譜是一種研究分子振動(dòng)的散射光譜，通過(guò)拉曼光譜不同的散射、吸收峰位置、退偏比和強(qiáng)度，可以推測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)型或者構(gòu)象的變化。從蛋白樣品的拉曼光譜中，我們可以獲得蛋白質(zhì)主鏈（酰胺Ⅰ帶的二級(jí)結(jié)構(gòu)）和側(cè)鏈（酪氨酸和色氨酸等）的結(jié)構(gòu)信息，以及蛋白質(zhì)的微環(huán)境變化。通過(guò)對(duì)蛋白樣品拉曼光譜的分析，可以研究在變性和聚合過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[22]。

2.2.1 對(duì)β－伴大豆球蛋白主鏈結(jié)構(gòu)的影響

β－伴大豆球蛋白的構(gòu)象主要由拉曼光譜中酰胺Ⅰ帶的C=O與C－N鍵的伸張來(lái)確定。參考已有研究，拉曼特征峰位置各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為：酰胺Ⅰ帶中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的子峰為1 640 cm－1～1 645 cm－1和 1 660 cm－1；α－螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的子峰為1 645 cm－1～1 655 cm－1；β－折疊結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的子峰為1 665 cm－1～1 680 cm－1；β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的子峰為1 680 cm－1～1 690 cm－1[23]。

蛋白質(zhì)的酰胺I帶常被用于蛋白質(zhì)的主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)表征，酰胺I帶中主要涉及C=O伸縮振動(dòng)和部分肽鍵間的N－H內(nèi)部彎曲振動(dòng)。蛋白質(zhì)的酰胺I帶二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的定量分析結(jié)果如表2所示。

表2 拉曼光譜測(cè)定不同超聲預(yù)處理β-伴大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量Table 2 Secondary structural content of β-conglycinin with ultrasound-treated estimated from Raman spectra%

由表2可知，不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件下β－伴大豆球蛋白的擬合分析結(jié)果表明，β－折疊結(jié)構(gòu)為含量最多的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。與未進(jìn)行超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）相比，經(jīng)過(guò)不同超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白樣品均表現(xiàn)出β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和α－螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，β－折疊結(jié)構(gòu)含量減少的趨勢(shì)。其中α－螺旋結(jié)構(gòu)含量最多增加3.14%，β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量最多增加1.22%，β－折疊結(jié)構(gòu)含量最多減少4.17%。這一結(jié)果說(shuō)明超聲波所引起的空穴效應(yīng)使得蛋白質(zhì)分子的交互作用受到破壞，維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，發(fā)生解聚和重排，導(dǎo)致β－伴大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。另外，研究表明降低的β－折疊結(jié)構(gòu)含量說(shuō)明蛋白質(zhì)疏水相關(guān)位點(diǎn)暴露，暴露的疏水性氨基酸殘基能促進(jìn)抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[24]，由此可見(jiàn)，經(jīng)超聲處理后蛋白質(zhì)的抗氧化性會(huì)有所提高。

2.2.2 對(duì)β－伴大豆球蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響

色氨酸在拉曼光譜圖上會(huì)表現(xiàn)出多個(gè)拉曼光譜帶，對(duì)于觀察蛋白質(zhì)微環(huán)境的極性及氫鍵變化規(guī)律有著重要作用。Wong等[25]研究表明在760 cm－1附近的拉曼峰強(qiáng)度降低與疏水性色氨酸殘基由包埋轉(zhuǎn)變?yōu)楸┞兜綐O性微環(huán)境有關(guān)。本試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白的拉曼圖譜，在760 cm－1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度有所降低，該區(qū)域歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動(dòng)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理后色氨酸殘基由包埋的疏水微環(huán)境轉(zhuǎn)為暴露的展開(kāi)形式，其中經(jīng)超聲預(yù)處理的 β－伴大豆球蛋白（B－7S）樣品，在 760 cm－1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度相對(duì)降低較大（p＜0.05，n=3），說(shuō)明在此條件下疏水氨基酸基團(tuán)暴露明顯。

酪氨酸側(cè)鏈微環(huán)境改變時(shí)，由于其苯環(huán)的吸收振動(dòng)和面外彎曲振動(dòng)會(huì)導(dǎo)致在 830 cm－1、850 cm－1附近的特征峰發(fā)生變化。特征峰850 cm－1和830 cm－1的強(qiáng)度比（I850/I830）可以反映酪氨酸側(cè)鏈中酚羥基離子化狀態(tài)或者氫鍵的性質(zhì)，兩者的比值已廣泛應(yīng)用于辨別酪氨酸殘基暴露和埋藏的程度。當(dāng)酪氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)時(shí)，I850/I830在 1.25～1.40 范圍內(nèi)；當(dāng)酪氨酸殘基趨向于“包埋”態(tài)時(shí)，I850/I830在 0.3～0.5 范圍內(nèi)；當(dāng)酪氨酸殘基呈電離態(tài)時(shí)，I850/I830比值為0.7。特征峰850 cm－1和830 cm－1的強(qiáng)度比（I850/I830），還能夠提供酪氨酸是氫鍵的受體還是氫鍵的供體方面的信息。當(dāng)二者的相對(duì)強(qiáng)度比（I850/I830）為最小值0.3時(shí)，表明酪氨酸的苯環(huán)上的羥基氧原子是強(qiáng)氫鍵的供體，如羧基氧。當(dāng)酪氨酸暴露到蛋白表面，環(huán)上的羥基氧原子同時(shí)作為中等強(qiáng)度氫鍵供體和受體，這時(shí)I850/I830的比值為1.25。當(dāng)二者的相對(duì)強(qiáng)度比（I850/I830）為2.5時(shí)，說(shuō)明酪氨酸的苯環(huán)上的羥基氧原子是強(qiáng)氫鍵的受體[26]。

本試驗(yàn)中，I850/I830的比值范圍為1.006～1.027，表明不同超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白的酪氨酸暴露到溶液的極性微環(huán)境中，并同時(shí)作為中等強(qiáng)度氫鍵的供體或受體。

不同超聲預(yù)處理β－伴大豆球蛋白色氨酸（760cm－1）、酪氨酸（I850/I830cm－1）及 C－H 振動(dòng)（1 450 cm－1）譜帶強(qiáng)度見(jiàn)表3。

由表3可知，與未超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白相比，經(jīng)過(guò)不同超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白的酪氨酸雙峰比值有所增加（p＜0.05，n=3），這說(shuō)明超聲預(yù)處理破壞了維持β－伴大豆球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵，使酪氨酸殘基從疏水環(huán)境的內(nèi)部展露到分子的表面，同時(shí)作為氫鍵的受體或供體與水發(fā)生相互作用，同時(shí)酪氨酸殘基暴露使850 cm－1處條帶強(qiáng)度比830 cm－1處條帶強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)增加蛋白質(zhì)的表面疏水性。

CH2和CH3的彎曲振動(dòng)在拉曼光譜中1 450 cm－1附近可以觀察到[27]。與未超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）相比，超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白拉曼光譜中1 450 cm－1處的譜帶強(qiáng)度增加，超聲預(yù)處理的β－伴大豆球蛋白 B－7S樣品（100 W，30min，50℃）譜帶強(qiáng)度達(dá)到最大值。在1 450 cm－1處C－H鍵強(qiáng)度的增加與疏水基團(tuán)暴露到極性環(huán)境的增加有關(guān)。通過(guò)拉曼光譜對(duì)β－伴大豆球蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的分析，說(shuō)明在低超聲強(qiáng)度下蛋白質(zhì)解聚，疏水性氨基酸暴露，當(dāng)超聲強(qiáng)度進(jìn)一步增加時(shí)，蛋白聚集導(dǎo)致微環(huán)境和極性的改變，使疏水基團(tuán)向包埋和微極性環(huán)境轉(zhuǎn)變，使譜帶強(qiáng)度降低。

表3 不同超聲預(yù)處理β-伴大豆球蛋白色氨酸（760 cm-1）、酪氨酸（I850/I830cm-1）及 C-H 振動(dòng)（1 450 cm-1）譜帶強(qiáng)度Table3 Normalizedintensitiesofthetryptophanband（760cm-1），the fermi-resonance doublet（I850/I830cm-1）of tyrosine and C-H band（1 450 cm-1）of β-conglycinin with different ultrasoundtreatment

2.3 超聲預(yù)處理對(duì)β-伴大豆球蛋白表面疏水性影響的分析

表面疏水性（H0）是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)，同時(shí)也是衡量蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)數(shù)目的指標(biāo)。表面疏水作用決定了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，功能性和穩(wěn)定性，是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和四級(jí)結(jié)構(gòu)的形成中占有突出的地位。相關(guān)報(bào)道顯示超聲作用能夠增加多種蛋白質(zhì)的表面疏水性，如大豆分離蛋白，乳清蛋白和卵白蛋白[27-28]。不同超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白的表面疏水性測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3 不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件β-伴大豆球蛋白的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of β-conglycinin with different ultrasound-treated

與未超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白相比，經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白的表面疏水性顯著升高（p＜0.05，n=3）。β-伴大豆球蛋白的表面疏水性隨超聲功率和溫度的升高，逐漸增大；隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。超聲預(yù)處理提高β-伴大豆球蛋白表面疏水性的原因主要有兩個(gè)：第一，超聲預(yù)處理能夠使β-伴大豆球蛋白的疏水基團(tuán)從分子內(nèi)部暴露到分子表面；第二，經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理之后，β-伴大豆球蛋白的粒度降低，空穴效應(yīng)對(duì)β-伴大豆球蛋白聚集物產(chǎn)生了解聚作用，解聚過(guò)程中讓更多的疏水基團(tuán)暴露在環(huán)境中增加蛋白質(zhì)的表面疏水性[29]。

2.4 超聲預(yù)處理對(duì)β-伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性影響的分析

不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率、還原能力和亞鐵離子螯合能力的影響，如圖4所示。

與未超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白酶解物相比，超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率、還原能力和亞鐵離子螯合能力顯著升高（p＜0.05，n=3）。由圖4可見(jiàn)，隨著超聲功率的增加，酶解物的抗氧化性逐漸減??；與之不同，隨著超聲時(shí)間和超聲溫度的增加，酶解物的抗氧化性先增加后減小。超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白（B-7S）經(jīng)蛋白酶水解后羥自由基清除率、還原能力和亞鐵離子螯合能力均為最強(qiáng)。

圖4 不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化性Fig.4 Antioxidant activity of β-conglycinin hydrolysate with different ultrasound-treated

通過(guò)對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果的分析，我們可以知道超聲預(yù)處理后β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，底物蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白酶解物的抗氧化活性有一定的影響[30]。當(dāng)β-伴大豆球蛋白經(jīng)過(guò)超聲功率100 W，超聲時(shí)間30min，超聲溫度50℃處理（B-7S）后，結(jié)構(gòu)變化最顯著且其酶解物抗氧化活性最高。通過(guò)對(duì)不同超聲預(yù)處理?xiàng)l件下β-伴大豆球蛋白的紫外光譜、拉曼光譜以及表面疏水性分析可知，由于超聲波的空穴作用及機(jī)械作用打亂了蛋白質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)暴露，如酪氨酸、色氨酸等從蛋白分子內(nèi)部展露到分子的外部，提高了蛋白質(zhì)的表面疏水性。超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白（B-7S）中酪氨酸和色氨酸暴露在蛋白質(zhì)分子表面最顯著（p＜0.05，n=3），酶解后容易得到側(cè)鏈中含有酪氨酸和色氨酸殘基的酶解物。酪氨酸和色氨酸可以向自由基提供氫原子，減慢或終止自由基鏈反應(yīng)，提高物質(zhì)的抗氧化活性[31]。超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性提高也可能是由于超聲預(yù)處理改變了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，更容易被酶水解，水解度增大，水解得到更多的小分子肽，提高了物質(zhì)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文研究表明β-伴大豆球蛋白經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理后采用堿性蛋白酶水解，其酶解產(chǎn)物與未經(jīng)超聲預(yù)處理的酶解產(chǎn)物相比，具有明顯增強(qiáng)的抗氧化活性，其中超聲功率為100 W，超聲時(shí)間為30min，超聲溫度為50℃（B-7S）時(shí)，β-伴大豆球蛋白抗氧化性最高。通過(guò)研究比較預(yù)處理前后β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理增加了β-伴大豆球蛋白的紫外吸收，使其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最多增加3.14%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量最多增加1.22%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量最多減少4.17%，促使疏水性氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）暴露，增加了蛋白的表面疏水性。超聲預(yù)處理后，β-伴大豆球蛋白發(fā)生解聚，疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面，利于蛋白酶水解獲得高抗氧化活性物質(zhì)。綜上所述，經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理的β-伴大豆球蛋白酶解物具有優(yōu)異的抗氧化能力，可以用于天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用。超聲預(yù)處理是一種輔助提高β-伴大豆球蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化能力行之有效的方法。但超聲預(yù)處理后β-伴大豆球蛋白究竟形成了怎樣一種易于酶解的結(jié)構(gòu)尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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