武建露，閆桂琴

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)院，山西 臨汾 041004)

1 引 言

魚精蛋白(Protamine)是一種從魚類精巢組織中分離獲得的多聚陽離子堿性蛋白。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里，它可延遲或阻止胰島素釋放，或作為肝素解毒劑等[1]。魚精蛋白作為一種新型的食品資源，具有高效抑菌活性[2]。同時(shí)，魚精蛋白也是近年發(fā)展起來的又一新型的天然高分子非病毒載體，鑒于魚精蛋白豐富的生物活性和重要的藥用價(jià)值，如何實(shí)現(xiàn)魚精蛋白快速、簡單的測定引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。

目前，關(guān)于魚精蛋白的測定方法報(bào)道的甚少，僅見于液相色譜法、傳統(tǒng)熒光法、電位滴定法等。這些方法中，液相色譜法需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，電化學(xué)法需要復(fù)雜的電極修飾過程，傳統(tǒng)熒光法雖然靈敏，但難以避免干擾物質(zhì)。因此，建立一種靈敏、準(zhǔn)確的魚精蛋白分析方法十分有必要。

碳量子點(diǎn)作為一種新興的納米材料，因其易于合成、定制的功能化及優(yōu)異的化學(xué)和膠體穩(wěn)定性對跨學(xué)科研究給予了巨大的希望[3]，它們內(nèi)在的光致發(fā)光性質(zhì)被稱為“納米亮點(diǎn)”[4]，特別是由于碳點(diǎn)的多色發(fā)射性能和生物相容性對發(fā)展生物成像和生物傳感非常重要[5]，碳量子點(diǎn)作為一種新型熒光探針，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析[6-7]和生物傳感[8]等研究領(lǐng)域。本文將氮原子摻入到碳點(diǎn)中。由于氮原子具有孤對電子，其進(jìn)入碳骨架后將有效調(diào)節(jié)碳點(diǎn)的本身性質(zhì)，如電子特征、表面或者局部的化學(xué)特性[9]。碳點(diǎn)的發(fā)射特性及其優(yōu)點(diǎn)已被用于生物傳感器開發(fā)，現(xiàn)已被應(yīng)用到臨床重要蛋白質(zhì)的檢測。因此本文參考Hu[10]的方法由下至上地快速、簡單、大規(guī)模合成氮摻雜熒光碳點(diǎn)(NCDs)。這種方法是將檸檬酸置于單乙醇胺中，通過簡單加熱實(shí)現(xiàn)的。其中單乙醇胺扮演了修飾劑和溶劑的雙重角色，而檸檬酸是碳源。該方法不需要特殊的儀器，在相對溫和的條件下(170℃，空氣環(huán)境)，能夠快速(10min)地一鍋合成大量(39.96g)的高質(zhì)量氮摻雜碳點(diǎn)。

本文的研究目的是通過表面修飾或自組裝(氫鍵、酸/堿質(zhì)子轉(zhuǎn)移、靜電作用)等功能化過程，使量子點(diǎn)與DNA通過靜電作用構(gòu)建一種納米復(fù)合物，并探索將該復(fù)合物作為熒光納米探針對魚精蛋白進(jìn)行檢測的可行性。雙鏈DNA的磷酸骨架(ds-DNA)通過負(fù)的靜電引力與帶有正電的NCDs相互吸引結(jié)合，形成了NCDs/DNA雜交物，使得NCDs的熒光明顯增強(qiáng)。有趣的是，當(dāng)將魚精蛋白加入到NCDs/DNA混合物中時(shí)，魚精蛋白能夠競爭結(jié)合DNA，于是雙鏈DNA和魚精蛋白由于強(qiáng)烈的親和力結(jié)合，使得DNA從NCDs表面脫落從而解除了NCDs熒光信號(hào)，NCDs的熒光恢復(fù)，因此，可以通過監(jiān)測熒光增強(qiáng)和恢復(fù)檢測魚精蛋白。

2 實(shí) 驗(yàn)

圖1為氮摻雜碳量子點(diǎn)/DNA納米探針測定魚精蛋白的原理示意圖。

圖1 氮摻雜碳量子點(diǎn)/DNA納米探針測定魚精蛋白的原理示意圖Fig.1 Principle of determination of protamine with NCDs/DNA nano probe

2.1 試劑和材料

單乙醇胺、鮭魚精子DNA(hsDNA)、魚精蛋白(Protamine)均購與美國Sigma公司。檸檬酸購于上海愛為科研公司。其他試劑都為分析純并按原樣使用。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 儀器

通過JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子，日本)觀察量子點(diǎn)形貌和微觀結(jié)構(gòu)，通過Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(瓦里安有限公司，美國)對熒光和共振光散射(Resnnanee Light Seattering，RLS)進(jìn)行信號(hào)測定(掃描波長200～800nm)，通過pH酸度劑(上海雷磁，中國)對pH值進(jìn)行測定。

2.3 氮摻雜碳點(diǎn)的合成

用檸檬酸作碳源大規(guī)模合成氮摻雜碳點(diǎn)。首先，將30g檸檬酸與230mL單乙醇胺混合，劇烈攪拌使其分散均勻。之后在冷凝回流的條件下，以大約20℃·min-1的速度加熱上述混合物至170℃并持續(xù)反應(yīng)10min。在上述過程中，混合物溶液由無色慢慢變?yōu)辄S色且顏色逐漸加深至棕黃色，這表明生成了氮摻雜碳點(diǎn)。10min后撤去熱源，將溶液自然冷卻至室溫。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去未反應(yīng)的單乙醇胺(蒸出的液體大約204mL)并真空干燥樣品，得到39.96g氮摻雜碳點(diǎn)粉末。

2.4 碳點(diǎn)的表征

熒光光譜(圖4)表明氮摻雜碳點(diǎn)具有激發(fā)波長依賴的熒光特性。當(dāng)激發(fā)波長從360nm調(diào)至440nm時(shí)，氮摻雜碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰峰位從451nm紅移至518nm。這種依賴于激發(fā)波長的熒光變化特性很可能與粒子尺寸不均一和表面發(fā)射缺陷點(diǎn)過多有關(guān)[12]。當(dāng)激發(fā)波長為370nm時(shí)，氮摻雜碳點(diǎn)具有最強(qiáng)的熒光發(fā)射，其峰位為365.085nm，半峰寬為75nm。以硫酸奎寧為參比，氮摻雜碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為40.3%，高于絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的碳納米材料的熒光量子產(chǎn)率。氮摻雜碳點(diǎn)的光學(xué)穩(wěn)定性好，在室溫下經(jīng)近一年的儲(chǔ)存后，其熒光強(qiáng)度仍基本保持不變，在350nm的紫外燈照射下仍能發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

圖2 NCDs的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of NCDs

圖3 NCDs的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of NCDs

圖4 不同激發(fā)波長下NCDs的熒光光譜Fig.4 Normalized FL spectra of NCDs under different excitation wavelengths

2.5 測定方法

為研究DNA對NCDs熒光強(qiáng)度的影響，將DNA溶于超純水中，濃度為400μg·mL-1(經(jīng)多次試驗(yàn)后找到的最佳濃度)，在一系列比色管中分別加入100～1000μL上述溶液，再分別加入(PBS10mol/mL，pH=7.4)0.5mL以及50μL濃度為1μg·mL-1的NCDs溶液于各比色管中。超純水定容至5mL，此時(shí)，DNA的濃度為8～88μg·mL-1。10min后進(jìn)行熒光光譜測定分析。對于魚精蛋白的檢測，先將一定量的魚精蛋白溶于水，制得1mg·mL-1溶液，接著在一系列比色管中依次加入(PBS10mol/mL pH=7.4)0.5mL，和50μL濃度為1μg·mL-1的NCDs溶液以及1000μL濃度為400μg·mL-1的DNA溶液以及5～50μL濃度為1mg·mL-1不同量的魚精蛋白溶液(定容后濃度為1～10μg·mL-1)，用高純水定容至5mL，靜止30min，進(jìn)行熒光檢測。激發(fā)波長為370nm，掃描范圍為400～600nm，取激發(fā)光譜的最大吸收峰值作為定量分析值。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光納米探針構(gòu)建原理

圖5 不同濃度的DNA與NCDs的RLS光譜Fig.5 RLS spectra of DNA and NCDs with different concentrations

通過Zeta電位進(jìn)一步分析可得，在pH=7.4時(shí)，該體系的Zeta電位值(Z)從+24.68mV下降到+17.23mV也證實(shí)，NCDs與DNA通過靜電作用使得DNA周圍的負(fù)電荷減少，與NCDs的正電荷結(jié)合。

此外，還合成了陰離子型碳點(diǎn)(ACD)來驗(yàn)證靜電吸引是否是形成混合物NCDs/DNA的驅(qū)動(dòng)力，并進(jìn)行了凝膠確認(rèn)。NCDs/DNA混合形成一個(gè)典型的瓊脂糖凝膠電泳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，stained with ethidium bromide(EB))，電泳是由ACD/DNA、NCDs 和NCDs/DNA 進(jìn)行的(NCDs和ACD為50μL，濃度為1μg·mL-1；DNA 為200μL，濃度為400μg·mL-1)。觀察比較發(fā)現(xiàn)EB染色的瓊脂糖凝膠電泳，ACD/DNA、NCDs/DNA 這兩條帶顏色顯著(圖6)。然而，在單純的含有NCDs條帶上，看不到任何熒光遷移現(xiàn)象。而在NCDs/DNA上，由于大多數(shù)自由的DNA和NCDs結(jié)合，NCDs/DNA的DNA帶也很微弱，但幾乎沒有DNA可以跟復(fù)雜的ACD結(jié)合，因此該條帶較亮。此外，密度分析該凝膠的發(fā)光區(qū)顯示，70%的DNA在和NCDs結(jié)合后不在凝膠中遷移。

圖6瓊脂糖凝膠電泳。(1)NCDs/DNA；(2)NCDs；(3)ACD/DNA。
Fig.6Agarose gel electrophoresis.(1)NCDs/DNA.(2)NCDs.(3)ACD/DNA.

3.2 NCDs對DNA的熒光響應(yīng)

DNA對NCDs的熒光強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)作用。我們在NCDs/DNA形成后測量每個(gè)溶液的發(fā)射光譜。通過增加DNA的量發(fā)現(xiàn)，NCDs的發(fā)射波長逐漸增大且發(fā)射最小值從310nm急劇增大到334nm，表明形成了納米混合物，如圖7所示。 隨著加入的 DNA濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，且增大效應(yīng)明顯(圖7)。隨著DNA濃度從8μg·mL-1增加到88μg·mL-1，熒光強(qiáng)度呈線性增大，嵌入圖表示濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，其線性方程為I/I0=0.0875CDNA+0.9416(R=0.995)。實(shí)驗(yàn)證明兩者之間發(fā)生了相互作用，可以通過熒光增強(qiáng)效應(yīng)來測定DNA的含量。

圖7 不同濃度的DNA熒光響應(yīng)Fig.7 Relationship between different concentrations of DNA and fluorescence intensity

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖8分別表示了溶液pH值和時(shí)間對DNA增強(qiáng)NCDs熒光強(qiáng)度的影響。如圖8(a)所示，pH值在4.0～9.0之間時(shí)，體系熒光較強(qiáng)，隨后開始逐漸降低。當(dāng)下降到pH值為6.5后又開始增強(qiáng)。直到pH值到8.3之后，熒光強(qiáng)度又有了較明顯的下降，但在6.5～7.4之間基本保持不變。因此，我們選擇pH值為7.4作為后續(xù)測定最佳pH條件，之后對該體系反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了測定，如圖8(b)所示。在加試劑后立即測定，在最初反應(yīng)時(shí)間之后每隔10min進(jìn)行一次測定，一直到90min后，反應(yīng)熒光強(qiáng)度基本都保持不變，說明該體系比較穩(wěn)定，時(shí)間對其影響不大。

圖8(a)pH值對氮摻雜碳量子點(diǎn)/肝素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響;(b)時(shí)間對氮摻雜碳量子點(diǎn)/肝素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。
Fig.8(a) Effect of pH value on fluorescence intensity of NCDs/DNA.(b) Effect of time on fluorescence intensity of NCDs/DNA.

3.4 NCDs/DNA自組裝納米探針對魚精蛋白的檢測

如圖9所示,在NCDs/DNA復(fù)合體系中加入魚精蛋白后，體系熒光強(qiáng)度隨著魚精蛋白的加入逐漸降低。而在單純的NCDs溶液中加入魚精蛋白，NCDs室溫?zé)晒鈴?qiáng)度基本保持不變，這歸因于NCDs與魚精蛋白在溶液中均呈現(xiàn)正電，二者不會(huì)發(fā)生相互作用。

圖10顯示在加入DNA與魚精蛋白后，紫外光照射下NCDs熒光視覺變化的順序。從左到右依次為NCDs、NCDs+DNA、NCDs+DNA+魚精蛋白。該圖直觀地表明，加入DNA后NCDs熒光顯著增強(qiáng)，但繼續(xù)加入魚精蛋白后，熒光有所降低，基本恢復(fù)到了原有熒光亮度，說明魚精蛋白能競爭結(jié)合DNA并使DNA從NCDs表面脫落，使得NCDs的熒光恢復(fù)。

圖9不同濃度的魚精蛋白對NCDs/DNA納米探針熒光強(qiáng)度的影響
Fig.9Effect of different concentrations of protamine on fluorescence intensity of NCDs/DNA nano probe

圖10 紫外光照射下NCDs熒光視覺變化Fig.10 Visual changes of NCDs fluorescence under UV irradiation

通過Zeta電位進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在PH為7.4時(shí)，單獨(dú)的NCDs溶液的Zeta電位為+24.68mV，加DNA使Zeta電位降為+17.23mV。在二者體系中繼續(xù)加入魚精蛋白后，Zeta電位又升至+24.62mV。這些結(jié)果也說明DNA能與NCDs通過靜電作用形成基態(tài)復(fù)合物使NCDs周圍的電荷減少，魚精蛋白會(huì)中和DNA本身的負(fù)電荷，由于魚精蛋白與DNA形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，從而減弱了DNA與NCDs之間的靜電作用，使DNA從NCDs表面脫離，Zeta電位也隨之恢復(fù)，NCDs的熒光得到恢復(fù)。

基于以上結(jié)果分析，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，我們建立了NCDs/DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度變化與魚精蛋白之間的線性響應(yīng)關(guān)系，如圖11所示，線性方程為I/I0=0.0396Cprotamine+0.5789(R=0.991)，線性范圍為1～10μg·mL-1。連續(xù)測定11次不含魚精蛋白和含1μg·mL-1體系熒光強(qiáng)度差值的相對偏差為6.8%，該方法檢出限(3σ/k)為0.61μg·mL-1。

就檢出限與檢出范圍與其他檢測方法相比較(表1)，該方法的檢出限明顯低于液相色譜法。此外，與相似的量子點(diǎn)熒光法比較，雖然檢出限高，但范圍更寬。且NCDs熒光法中，量子點(diǎn)的合成更簡單，原料更便宜環(huán)保，操作更簡單。

圖11NCDs/DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度變化與魚精蛋白之間的線性響應(yīng)關(guān)系曲線
Fig.11Linear response curve between fluorescence intensity of NCDs/DNA complex and protamine

表1 魚精蛋白測定中不同分析方法的比較Tab.1 Comparison of the proposed method with different analytical techniques reported for determination of protamine

3.5 外源物質(zhì)的干擾

為探究NCDs對肝素選擇的靈敏性及生物體液中常見小分子、離子對該檢測體系的干擾，我們做了以下干擾實(shí)驗(yàn)(表2)。在5 μg·mL-1魚精蛋白存在的環(huán)境下，1 000倍的Na+、1 000倍的K+、150倍的Mg2+、200倍的Ca2+、500倍的Glucose、500倍的Lysozyme、140倍的Arginine、80倍的BSA、50倍的HA、50倍的KS對魚精蛋白的檢測造成的影響不明顯，其中Lysozyme影響稍高，可能和其帶有正電與一小部分DNA發(fā)生了靜電作用有關(guān)，但影響并不大可以忽略。因此，在實(shí)際檢測中外源物質(zhì)對該檢測方法干擾較小，以上結(jié)果證明，該方法具有良好的選擇性。

表2 外源物質(zhì)的干擾Tab.2 Tolorance of foreign substances

4 結(jié) 論

基于氮摻雜碳量子點(diǎn)和DNA之間強(qiáng)烈的靜電作用，構(gòu)建了一種快速、簡單、靈敏的自組裝納米探針檢測魚精蛋白。該方法有效地利用NCDs量子點(diǎn)特有的熒光性質(zhì)，使DNA通過靜電作用與NCDs量子點(diǎn)結(jié)合并將量子點(diǎn)的熒光增強(qiáng)。隨后加入魚精蛋白，魚精蛋白與DNA相互作用并結(jié)合，將DNA從NCDs量子點(diǎn)表面解吸，進(jìn)而使得NCDs量子點(diǎn)的熒光得到恢復(fù)?；贜CDs量子點(diǎn)熒光性質(zhì)的檢測方法與傳統(tǒng)的方法相比較，不需要添加任何誘導(dǎo)劑及除氧。該納米探針可在濃度范圍1～10 μg·mL-1內(nèi)有效檢測魚精蛋白，檢出限為0.61 μg·mL-1。此外，該檢測法具有成本低、無毒、環(huán)保、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。

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