龐 燕，王海軍，馮維貴，王玉斌

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

葉酸受體是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的膜糖蛋白，分子量為38～40 kD，包括α、β和γ/γ′3種亞型。葉酸受體基因表達有很強的組織和腫瘤特異性，在正常組織中低表達，而在一些腫瘤組織中高表達，α亞型在正常組織中低表達，在上皮細胞系腫瘤，例如卵巢癌、腎癌、睪丸癌、腦癌、結(jié)腸癌中高表達；β亞型僅在胎盤、粒單核細胞系中成熟的中性粒細胞、被激活的單核或巨噬及超過半數(shù)以上的髓系白血病細胞中高表達，在其他組織中幾乎不表達；γ/γ′亞型被認為是特異性表達在造血組織中，但也只是低表達[1，2]。

1 葉酸受體腫瘤顯像劑的研究進展

目前已報道的用于標記葉酸受體放射性藥物的核素有66/67/68Ga，111In，99mTc及18F 等。

1.1 66/67/68Ga標記的顯像劑

1.1.1 66/67/68Ga-DF-folate C J Mathias等報道，67Ga和66/68Ga與DF-folate（DF，去鐵胺）偶聯(lián)后可以作為葉酸受體腫瘤顯像劑進行顯像，DF-folate結(jié)構(gòu)如圖1所示。67Ga-DF-folate在荷KB細胞（人體口腔上皮癌細胞）腫瘤小鼠體內(nèi)，腫瘤中攝取較高[（5.2±1.5）%ID/g，4 h p.i]，瘤/血比和瘤/肉比分別為409±195和124±47。同時，文獻報道66Ga和68Ga亦可以用來標記DF-folate，其中 66Ga-DF-folate在荷KB細胞腫瘤小鼠的MicroPET顯像中，腫瘤和腎臟的顯像清晰，具有很高的靈敏性[3，4]。

圖1 DF-folate的結(jié)構(gòu)

1.1.2 67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate 2011年，Cristina Muller等標記得到67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate（結(jié)構(gòu)如圖2所示）。體外細胞結(jié)合實驗中，此標記物對葉酸受體表現(xiàn)出較強的親和力。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate在腫瘤中攝取較高[（6.08±0.89）%ID/g，4 h p.i]，并且滯留時間較長[（5.54±0.36）%ID/g，24 h p.i]。除了唾液腺和腎臟中特異性攝取較高外，非靶器官攝取很低，4 h瘤/血比為56.28±9.04。由于腎臟特異性攝取較高，會影響顯像效果并對腎臟產(chǎn)生毒副作用，筆者提前注射培美曲塞，達到了降低腎臟攝取的目的，4 h瘤/血比由84.53±14.10降到19.09±1.63，同時腫瘤中攝取變化不大，由（6.08±0.89）%ID/g變?yōu)椋?.15±0.77）%ID/g。荷瘤小鼠SPECT顯像結(jié)果與生物分布結(jié)果一致，標記物能清晰顯示腫瘤位置，提前注射培美曲塞后腫瘤顯像依然清晰，但是腎臟攝取量大大降低[5]。

圖2 DOTA-Bz-EDA-folate的結(jié)構(gòu)

1.2 111In標記的顯像劑

1.2.1111In-DTPA-folate111In-DTPA-folate是第一個進入并完成Ⅱ期臨床試驗的葉酸受體腫瘤顯像劑。DTPA-folate結(jié)構(gòu)如圖3所示。2003年，Siegel BA等對111In-DTPA-folate作為診斷卵巢癌的一種顯像劑就其安全性、生物分布和可能性進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，33例卵巢癌患者中，111In-DTPA-folate對惡性卵巢實體瘤診斷的靈敏度達100%。這種顯像劑能很好地區(qū)分良、惡性腫瘤，但在診斷再發(fā)性卵巢癌和子宮內(nèi)膜惡性實體瘤時，效果不太理想。111In為利用加速器生產(chǎn)的放射性核素，且半衰期較長（T1/2=67.3 h），這使得在對其進行商業(yè)推廣時遇到了很大障礙[6]。

圖3 DTPA-folate的結(jié)構(gòu)

1.2.2111In-DTPA-NOON-Pteroyl 2005 年，Chun Yen Ke等利用氨基乙醚鏈取代葉酸分子中的谷氨酸殘基形成的蝶酸NOON橋與111In-DTPA相連得到111In-DTPA-NOON-Pteroyl。Pteroyl-NOON-DTPA結(jié)構(gòu)如圖4所示。111In-DTPA-NOONPteroyl在荷KB細胞腫瘤小鼠體內(nèi)生物分布情況與111In-DTPA-folate相似，證明去掉葉酸分子中的谷氨酸部分并不會影響葉酸受體的親和性[7]。

圖4 Pteroyl-NOON-DTPA的結(jié)構(gòu)

1.3 99mTc標記的顯像劑

1.3.199mTc-DTPA-folate Carla J Mathias等制備得到99mTc-DTPA-folate。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，99mTc-DTPA-folate除了在血液中濃度較高外，其他生物分布與111In-DTPA-folate相仿。但是，由于標記物的放射化學純度以及穩(wěn)定性與配體DTPA-folate用量有關(guān)，當配體量與111In-DTPA-folate中配體量相當時，其放射化學純度和穩(wěn)定性不太理想[8]。

1.3.299mTc-EC20 EC20是含有葉酸結(jié)構(gòu)類似物的肽（如圖5所示）。在BALB/c小鼠模型（接種M109腫瘤）中，99mTc-EC20在腫瘤中攝取很高[（17.2±1.02）%ID/g，4 h p.i]，在血液等非靶組織中的清除速度很快，并以原藥形式從尿液中排出。其腫瘤攝取以及瘤/血本底比值可以與111In-DTPA-folate相比。目前，99mTc-EC20已用于卵巢癌、宮頸癌和腎癌等的Ⅰ期臨床試驗，Ⅱ期臨床試驗也正在進行[9，10]。

圖5 99mTc-EC20的結(jié)構(gòu)

1.3.399mTc-HYNIC-folate雙功能連接劑HYNIC（肼基煙酰胺）與葉酸分子偶聯(lián)形成HYNIC-folate（如圖6所示）。在共配體tricine/TPPTS的作用下，用99mTc進行標記可得到配合物99mTc-HYNIC-folate。在荷葉酸受體陽性腫瘤24 JK-FBP的小鼠模型中，藥物在腫瘤中攝取很高[（17.84±11.43）%ID/g，4 h p.i]，4 h時瘤/血比和瘤/肉比分別為 55±19.2和 28.2±14.8，比111In-DTPA folate和67Ga-DF-folate在KB細胞腫瘤小鼠模型中的瘤/血本底比值低，主要因為24JK-FBP中葉酸受體密度較小所致。但是由于其葉酸受體含量和人體腫瘤中葉酸受體含量近似，所以這種腫瘤模型對研究人體腫瘤更有意義[11]。

圖6 99mTc-HYNIC-folate的結(jié)構(gòu)

1.3.499mTc-（CO）3-DTPA-folate中間體[99mTc（CO）3（H2O）3]+與DTPA-folate反應可生成99mTc（CO）3-DTPA-folate。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，腫瘤攝取較高4 h時為（3.3±0.2）%ID/g，靶與非靶比值低于111In-DTPA-folate和99mTc-DTPA-folate，與其他葉酸的螯合物相比，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的優(yōu)越性。但是，為99mTc標記葉酸提供了新的思路[12]。

1.3.599mTc-histidine-folate Cristina Muller等利用鏈接化學（Click Chemi stry）的方法合成了99mTc-histidine-folate（如圖7所示）。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，標記物在腫瘤中攝取較高[（4.29±0.67）%ID/g，4 h p.i]，且滯留時間較長[（3.51±0.37）%ID/g，24 h p.i]，除腎臟外非靶器官攝取很低。4 h荷瘤小鼠SPECT顯像，取得較好的顯像結(jié)果[13]。

圖7 99mTc-histidine-folate的結(jié)構(gòu)

1.3.699mTc（X）（tricine/TPPTS） 陸潔等對葉酸分子進行結(jié)構(gòu)修飾后與雙功能連接劑HYNIC相連，在tricine/TPPTS存在情況下，進行99mTc標記，得到一系列配合物，如99mTc（HYNIC-NHHNFA）（tricine/TPPTS）和99mTc（HYNIC-lys-pteroyl）（tricine/TPPTS）。HYNIC-NHHN-FA與HYNIC-lys-pteroyl結(jié)構(gòu)如圖8、9所示。體外細胞結(jié)合實驗顯示，兩種配合物與葉酸受體有較好的親和力。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，兩種配合物在腫瘤中攝取很高，99mTc（HYNIC-NHHN-FA）（tricine/TPPTS）注射后 4 h 最高為 （9.79±1.6）%ID/g，99mTc-（HYNIC-lys-pteroyl）（tricine/TPPT S），2 h最高為（9.60±1.46）%ID/g。兩者除了腎臟特異性攝取較高外，腹部其他臟器攝取很低并且清除很快，有很高的靶與非靶比值。99mTc（HYNIC-lys-pteroy）l（tricine/TPPTS） 在荷瘤小鼠SPECT顯像中，能夠清晰顯示腫瘤位置[14，15]。

圖8 HYNIC-NHHN-FA的結(jié)構(gòu)

圖9 HYNIC-lys-pteroyl的結(jié)構(gòu)

1.4 18F標記的顯像劑

1.4.118F-FBA-folate 2006年，Andrea Bettio等標記得到18F-FBA-folate（α）和18F-FBA-folate（γ），結(jié)構(gòu)如圖 10、11 所示。兩種化合物的IC50（半抑制率）分別為（71±8）nmol/L和（62±6）nmol/L，與葉酸（IC50為41 nmol/L）相比，兩種標記物對葉酸受體的親和力相近。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，注射后125 min18F-α/γ-FBA-folate 在腫瘤中的攝取為（6.56±1.80）%ID/g，腎臟、膽汁、尿液和糞便中有很高的攝取，腎臟為（40.65±12.81）%ID/g，膽汁為（265.80±164.13）%ID/g，尿液為（130.71±92.52）%ID/g，糞便為（29.54±19.98）%ID/g。在荷瘤小鼠 PET 顯像中，腫瘤顯像清晰，但是由于腹部攝取過高影響進一步推廣[16]。

1.4.218F-click-folate 2008年，Tobias L Ross等將Click化學合成方法應用于18F標記過程，得到18F-click-folate，結(jié)構(gòu)如圖12所示。整個標記過程大約需要90 min，放化產(chǎn)率最高可達35%。體外細胞結(jié)合實驗測得標記物Ki（抑制常數(shù)）為（9.76±3.13）nM，高于葉酸的（0.61±0.19）nM。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，腫瘤攝取較低[（3.13±0.83）%ID/g，45 min p.i]，主要是由于此標記物脂溶性很強，主要通過肝膽代謝，膽汁、糞便和尿液攝取很高，45 min 時分別為 （667.36±530.09）%ID/g，（56.00±27.64）%ID/g和（49.92±15.58）%ID/g。與18F-FBA-folate的相同點是，在荷瘤小鼠體內(nèi)PET顯像中，此偶聯(lián)物可以在葉酸受體高表達的腫瘤部分顯示出特異性攝取，但是同樣由于腹部攝取過高影響顯像效果[17]。

圖10 18F-FBA-folate（α）的結(jié)構(gòu)

圖11 18F-FBA-folate（γ）的結(jié)構(gòu)

圖12 18F-click-folate的結(jié)構(gòu)

1.4.318F-FFA 繼18F-FBA-folate和18F-click-folate后，Tobias L Ross團隊又將18F標記到葉酸分子上，得到18F-FFA（如圖13所示），整個標記過程大約需要80 min，衰變矯正后最高產(chǎn)率為4%。體外結(jié)合實驗測得該標記物Ki為（1.8±0.1）nM，與葉酸分子的Ki[（0.6±0.2）nM]接近。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，腫瘤攝取較高[（9.37±1.76）%ID/g，75 min p.i]。由于親水性增強，18F-FFA較18F-FBA-folate和18F-click-folate在膽汁、小腸、糞便等腹部非靶器官中的攝取大大降低，主要通過腎臟（尿）代謝。在PET顯像中，18F-FFA能清楚顯示腫瘤和腎臟的位置。為了降低腎臟攝取，筆者提前注射培美曲塞，75 min后從（35.73±0.25）%ID/g 降至（14.05±1.02）%ID/g，同時腫瘤的攝取變化不大，由（11.50±0.28）%ID/g降至（8.65±3.05）%ID/g[18]。

圖13 18F-FFA的結(jié)構(gòu)

1.4.418F-Deoxy-Glucose-folate 2012年，Cindy R Fischer等將葡萄糖實體引入標記物分子中（如圖14所示），這樣的設(shè)計大大提高了標記物的水溶性（logD7.4=-4.2±0.1），但是標記過程較為復雜，耗時大約3 h，校正后產(chǎn)率最高可達25%，放射化學純度大于95%。體外細胞結(jié)合實驗中，此標記物對葉酸受體顯示出很好的親和力。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，18F-Deoxy-Glucose-folate表現(xiàn)出很高的腫瘤攝取[（10.03±1.12）%ID/g，60 min p.i]，并且滯留時間較長[（9.05±2.12）%ID/g，90 min p.i]。非靶器官攝取很低，90 min瘤/肝比、瘤/腎比和瘤/肉比分別為 1.28±0.22、0.34±0.07 和 36.09±15.37。與99mTc-EC20 相比，18F-Deoxy-Glucose-folate有相似的生物分布。與其他文獻報道肝臟、糞便、膽汁等腹部非靶器官中的非特異攝取，在荷瘤小鼠PET顯像中取得了很好的顯像結(jié)果[19]。

圖14 18F-Deoxy-Glucose-folate的結(jié)構(gòu)

1.4.5 2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate I Al Jammaz等標記得到2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate（如圖15所示），整個標記過程大約45 min，放化產(chǎn)率大于80%，放射化學純度大于97%。在體外細胞結(jié)合實驗中，此標記物顯示出對葉酸受體較強的親和力，解離常數(shù)Kd為（15.51±1.80）nM。在荷KB細胞腫瘤小鼠模型中，腫瘤攝取雖然不是很高[（5.74±0.16）%ID/g，60 min p.i]，但是除了腎臟特異性攝取較高外，非靶器官攝取很低（均小于1.00%ID/g），在荷瘤小鼠micro PET顯像中取得了很好的顯像結(jié)果[20，21]。

圖15 2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate的結(jié)構(gòu)

2 結(jié)語

近年來，受體介導的靶向分子探針成為放射性藥物研發(fā)的重點。與其他靶向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相比，葉酸受體具有親和力強、分子量小、價格低廉、易于結(jié)構(gòu)修飾、化學和生物穩(wěn)定性好、無免疫原性等優(yōu)點，葉酸及其類似物偶聯(lián)的葉酸受體藥物成為靶向藥物研究的熱點。目前，大多數(shù)葉酸受體介導的放射性藥物的研究僅限于實驗階段，而尋找更好的標記方法、更優(yōu)的連接劑，提高藥物體內(nèi)靶向性是今后需要解決的問題。

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