王妙瑩,許旭萍,王維奇,王廣磊,蘇程舉

1 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350108 2 福建師范大學(xué)地理研究所, 福州 350007 3 濕潤亞熱帶生態(tài)地理過程教育部重點實驗室, 福州 350007

甲烷(CH4)是僅次于二氧化碳(CO2)的重要溫室氣體,對溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)約為18%[1],其單分子增溫潛勢是CO2的28—36倍[2]。農(nóng)業(yè)活動是大氣中溫室氣體的主要來源,其中稻田是CH4最重要的農(nóng)業(yè)源。研究表明,稻田每年的CH4排放量約占全球CH4排放總量的10%[3]。水稻田在發(fā)展糧食生產(chǎn)的同時也加劇了溫室氣體CH4的排放量,這將會加速全球氣候變暖。因此,如何協(xié)調(diào)糧食增產(chǎn)與溫室氣體減排,具有重要的理論和現(xiàn)實意義[4]。稻田CH4減排是當(dāng)今的研究熱點,近年來,稻田施加工農(nóng)業(yè)廢棄物的研究已日益增多,其中研究較多的廢棄物種類主要有秸稈、生物炭和爐渣[5- 8]。由于生物炭來源于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生活木質(zhì)物質(zhì)廢棄物,含有豐富的鉀、鈣、鎂元素,可改良土壤[9- 10],國內(nèi)外研究學(xué)者開展生物炭施加改善土壤理化性質(zhì)、增加糧食產(chǎn)量、溫室氣體減排的相關(guān)研究已取得一定成效[11- 14]。當(dāng)前,國際上一些學(xué)者發(fā)現(xiàn),在溫帶稻田施加爐渣可提高水稻產(chǎn)量并減少CH4排放[6],Ali等[4]認(rèn)為爐渣的增產(chǎn)減排作用與爐渣中含有氧化鐵和硅、鈣、鎂等營養(yǎng)元素密切相關(guān)[15]。然而,廢棄物施加減少稻田CH4排放的微生物學(xué)機(jī)制的研究還較薄弱。

產(chǎn)甲烷菌是一類嚴(yán)格厭氧的微生物,影響著稻田CH4的產(chǎn)生。近年來,靶標(biāo)特定微生物16S rRNA基因和功能基因已廣泛應(yīng)用于稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性的檢測[16- 18],采用此分子生物學(xué)技術(shù),人們發(fā)現(xiàn)稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的主要類群包括有甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷桿菌目(Methanobacteriales)等幾個目[19- 21]。其中,甲烷桿菌目(Methanobacteriales)的甲烷桿菌屬(Methanobacterium)以及甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)的甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)和甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)的相對豐度與CH4產(chǎn)生關(guān)系密切[14,22- 23]。研究表明,土壤環(huán)境、水肥管理以及水稻生育時期均會使稻田產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)而影響稻田CH4的排放[22,24- 26]；Dubey等[25]研究發(fā)現(xiàn)變性土產(chǎn)甲烷菌的主要類群為甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae),與土壤富含乙酸、有機(jī)碳含量較高有關(guān)；Bao等[22]研究指出,由于較高的鉀含量、接近中性的pH值以及較少粘土性質(zhì),使得粉砂壤土樣地的CH4產(chǎn)生高于粉砂粘土樣地；底物類型是影響產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素。然而,關(guān)于廢棄物施加對稻田土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成及其結(jié)構(gòu)影響的研究鮮有報道。董達(dá)等[27]研究發(fā)現(xiàn)生物炭輸入可通過提高土壤pH、通氣性和土壤養(yǎng)分含量,降低土壤容重和溶解性有機(jī)碳(DOC),抑制乙酸型產(chǎn)甲烷菌Methanosarcina和Methanosaeta的生長,實現(xiàn)稻田CH4的減排。與此同時,也有研究表明,生物炭施加的減排效應(yīng)與生物炭抑制產(chǎn)甲烷菌活性或提高甲烷氧化活性有關(guān)[28- 30],還有一些學(xué)者認(rèn)為生物炭是通過提高甲烷氧化菌豐度或降低mcrA/pmoA比值來減少稻田CH4排放[30- 31]。由此可見,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為施加生物炭有減少CH4排放作用,但其微生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另一方面,多位研究者認(rèn)為爐渣減少CH4排放的主要原因是爐渣中富含的氧化鐵作為電子受體抑制產(chǎn)甲烷菌的活性[6,32- 33],然而爐渣施加是否還可能通過影響稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)來減少稻田CH4產(chǎn)生量,尚不清楚。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)水稻拔節(jié)期的CH4排放通量高于乳熟期[34]?；诖?本研究以福州平原紅壤稻田為研究對象,對稻田進(jìn)行爐渣、生物炭單一施加和混合施加處理,分析不同施加處理條件下水稻拔節(jié)期(淹水階段)土壤理化性質(zhì)的差異,并以產(chǎn)甲烷菌功能基因(mcrA)為分子標(biāo)記,利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)結(jié)合克隆測序?qū)υ纭⑼淼景喂?jié)期的稻田土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,了解廢棄物施加對稻田土壤產(chǎn)甲烷菌組成結(jié)構(gòu)的影響、減排的微生物學(xué)機(jī)制；正確評估廢棄物施加對稻田土壤理化性質(zhì)的影響及其與產(chǎn)甲烷菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與稻田CH4排放通量之間的關(guān)系,為廢棄物施加減少CH4排放通量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究區(qū)位于閩江河口區(qū)福州平原的南分支—烏龍江北岸,海拔3—5m,屬亞熱帶季風(fēng)氣候。實驗區(qū)位于福建省農(nóng)科院水稻所吳鳳綜合試驗基地(25°59′44.12″N, 119°38′35.50″E,圖1)內(nèi),試驗地點概況參見文獻(xiàn)[34- 35]。

圖1 采樣點位置圖Fig.1 Location of sampling site

1.2 施加物

爐渣主要含有SiO2(27.7%)、CaO(35.7%)、SO3(1.3%)、Fe2O3(6.2%)、P2O5(0.1%)、MgO(4.3%)和K2O(2.7%)。

生物炭主要含有N(1.4%)、P(1.0%)、K(1.8%)、C(56.6%)、S(0.6%)、Mg(1.0%)、Ca(0.5%)和Fe(0.2%)。

爐渣、生物炭在使前先用孔徑為2mm的篩子過篩處理[32]。

1.3 水稻品種

早稻品種為江西省農(nóng)科院研發(fā)的禾盛10號；晚稻品種為福建省農(nóng)科院研發(fā)的沁香優(yōu)212號。

1.4 施加處理方法

本實驗分別于2015年早稻和晚稻種植期間各進(jìn)行一次施加處理(早、晚稻在相同試驗區(qū)內(nèi))。其中早稻生長期為2015年4月16日到2015年7月16日,晚稻生長期為2015年7月25日到2015年11月6日。本實驗設(shè)置爐渣、生物炭、爐渣和生物炭混施3種施加處理,以不施加處理作為對照組(早稻收獲后種植晚稻,晚稻試驗小區(qū)的前季早稻并未有添加試驗,僅在晚稻種植時添加)。在水稻移栽前一次性施加到犁耕層土壤中(0—15cm)。爐渣、生物炭的施加量均為8t/hm2,混施處理的施加量為爐渣、生物炭各施8t/hm2。每個處理設(shè)置3個重復(fù),共12個小區(qū),每個小區(qū)面積10m2,隨機(jī)區(qū)組排列。各小區(qū)之間用0.5cm厚、30cm高的PVC板隔離小區(qū),防止水體和物質(zhì)交換。樣地施肥情況參見文獻(xiàn)[34- 35]。

1.5 土壤樣品采集

分別于早稻、晚稻拔節(jié)期(淹水階段),在每個重復(fù)樣地,用采土器采集每個試驗小區(qū)0—15cm土柱,裝入自封袋帶回實驗室,采集的每份土樣分為兩部分,一部分用于土壤理化指標(biāo)測定,另一部分置于-20℃冰柜保存用于后續(xù)的DNA提取及產(chǎn)甲烷菌測定。

1.6 土壤樣品理化指標(biāo)測定

土壤pH值采用IQ150便捷式pH計(IQ Scientific Instruments, USA),土壤電導(dǎo)率采用2265FS便捷式電導(dǎo)計(Spectrum Technologies Inc., USA)測定,并以此表征土壤鹽度。土壤容重采用環(huán)刀法測定,含水量采用鋁盒烘干法測定[36]。土壤有機(jī)碳(SOC)和全氮(TN)采用碳氮元素分析儀測定(Elementar Vario MAX CN, Germany)。

1.7 產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

1.7.1 土壤總DNA提取

將每個處理的3個重復(fù)土樣混合成1份樣品,稱取新鮮土壤0.5g,用E.Z.N.ATMSoil DNA Kit(OMEGA, USA)進(jìn)行土壤總DNA的提取和純化。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA純度和濃度通過超微量紫外分光光度計(NanoDrop, USA)檢測。收集的DNA存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)擴(kuò)增和純化

利用產(chǎn)甲烷菌mcrA基因的特異性引物ME1和ME2[37](GCMATGCARATHGGWATGTC)/(TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT),以土壤總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL,dNTP 2μL,引物ME1/ME2各0.5μL,DNA模板0.5μL,ExTaq酶0.25μL,加入ddH2O至25μL。

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min,30個循環(huán)：94℃變性45s,48℃退火1min,72℃延伸90s；72℃延伸10min。擴(kuò)增得到的mcrA基因經(jīng)過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫外燈切下含目的DNA片段的凝膠條帶,用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(Sangon,China) 回收純化。

1.7.3 產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)克隆文庫的構(gòu)建

mcrA基因與pMDTM18-Tvector(TaKaRa)載體連接后,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,待菌液吸收后37℃倒置培養(yǎng)12—16h；挑選白色克隆子構(gòu)建克隆文庫。在構(gòu)建的文庫中挑取100個陽性克隆進(jìn)行菌落PCR驗證,根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小鑒定重組子。菌落PCR擴(kuò)增采用PMDTM18—Tvector載體的通用引物M13-47/RV-M(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)/(GAGCGGATAAT TTCACACAGG)。

菌落PCR擴(kuò)增體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL,dNTP 2μL,上下游引物各0.5μL,DNA模板(單菌落)適量,ExTaq酶0.2μL,加入ddH2O 至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min,30個循環(huán)：94℃變性45s,48℃退火1min,72℃延伸90s；72℃延伸10min。

1.7.4 產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)克隆文庫的RFLP分析和測序

選取含有正確插入片段的陽性克隆并對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行MspI(TaKaRa, Japan)酶切。酶切反應(yīng)體系(10μL)[38]：10×T緩沖液 1μL,0.1%BSA 1μL,菌落PCR產(chǎn)物5μL,限制性內(nèi)切酶MspI 0.5μL,ddH2O 2.5μL。將上述酶切體系放置37℃水浴酶切3h。經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段并用凝膠成像系統(tǒng)采集照片。酶切圖譜完全一樣的作為一個操作分類單位(operational taxonomic unit, OTU)。將具有不同譜型的克隆子進(jìn)行測序。

1.7.5 稻田土壤產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將所獲得的基因序列提交GenBank,通過BLAST程序搜索相似序列,從數(shù)據(jù)庫中檢索最匹配的序列,利用Clustal X軟件進(jìn)行相似性分析。采用MEGA4.0軟件中的鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并用Bootstrap 檢驗(替代率為l 000)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7.6 稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性分析

根據(jù)克隆文庫酶切圖譜結(jié)果進(jìn)行多樣性分析并計算克隆文庫的庫容C。多樣性指數(shù)包括酶切類型數(shù)、單一酶切類型數(shù)、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H′)和辛普森多樣性指數(shù)(D)。庫容C計算公式如下[39]：

C=(l-nl/N)×100%

式中,N代表克隆文庫總克隆數(shù),nl代表在文庫僅出現(xiàn)1次的OTU的數(shù)量。香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H′)和辛普森多樣性指數(shù)(D)采用Bio-dap軟件進(jìn)行計算分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2003和SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。采用Excel 2003計算原始數(shù)據(jù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 17.0中的單因素方差分析對同一生長季不同處理間的土壤理化性質(zhì)進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻田土壤理化性質(zhì)

不同施加處理條件下早、晚稻拔節(jié)期的土壤理化性質(zhì)如表1所示。早稻拔節(jié)期,對照、爐渣、生物炭和混施處理的土壤鹽度變化范圍為0.20—0.57mS/cm,其中混施處理顯著提高土壤鹽度(P<0.05),提高比例為185.00%；不同施加處理的pH值變化范圍為6.33—7.41,混施處理顯著提高土壤pH(P<0.05),提高比例為17.06%。與對照相比,施加處理的土壤容重、含水量和全氮無顯著差異(P>0.05)；與對照相比,爐渣、生物炭和混施處理的土壤有機(jī)碳含量分別提高了2.89%、5.60%和33.96%；與對照相比,爐渣、生物炭和混施處理的碳氮比值分別提高了1.07%、5.82%和27.80%。

晚稻拔節(jié)期,混施處理顯著提高土壤鹽度(P<0.05),提高比例為104.35%；爐渣和混施處理顯著提高土壤pH(P<0.05),提高比例分別為13.49%和18.59%。與對照相比,施加處理的土壤容重、含水量和全氮無顯著差異(P>0.05),與對照相比,爐渣、生物炭和混施處理的土壤有機(jī)碳含量分別提高了2.80%、33.38%和37.64%；與對照相比,爐渣、生物炭和混施處理的碳氮比值分別提高了0.62%、21.03%和24.48%。綜合早、晚稻土壤理化性質(zhì)可知,與對照相比,施加處理對早、晚稻拔節(jié)期土壤理化性質(zhì)的影響基本一致。即施加處理提高土壤鹽度,其中混施處理最為明顯,且爐渣、生物炭和混施處理也提高土壤pH,其中爐渣和混施處理對土壤pH影響較大；此外,生物炭和混施處理還提高了土壤有機(jī)碳含量和碳氮比值。

表1 施加處理稻田土壤的理化性質(zhì)

不同字母表示同一生長季不同處理樣地之間具有顯著差異,P<0.05

2.2 土壤總DNA提取及產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)的擴(kuò)增

利用土壤提取試劑盒對早、晚稻不同施加處理共8個土壤樣品進(jìn)行總DNA提取,其A260/A280值均在1.80以上(表2),表明提取的DNA純度較高,滿足下一步PCR對于模板的要求。以提取的DNA為模板可擴(kuò)增出約為760bp的目的片段,與預(yù)期的mcrA基因的分子大小相符(圖2)。

表2 施加處理稻田土壤總DNA的提取結(jié)果

圖2 稻田土壤m(xù)crA基因擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of mcrA gene in paddy fields 1—4泳道分別表示早稻對照、爐渣、生物炭和混施處理的樣品；5—8泳道分別表示晚稻對照、爐渣、生物炭和混施處理的樣品

2.3 產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)克隆文庫的構(gòu)建及PCR-RFLP分析

將不同施加處理稻田土壤產(chǎn)甲烷菌陽性克隆的菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離,酶切電泳圖譜(部分)如圖3所示。分析酶切譜型,將酶切圖譜完全一樣的譜型歸為一個OTU,對照、爐渣、生物炭和混施處理的早稻土壤產(chǎn)甲烷菌的酶切圖譜分別得到19、18、20和22個OTU,4種處理的晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌的酶切圖譜分別得到22、18、19和27個OTU,將不同譜型的克隆子進(jìn)行測序后經(jīng)Bio-dap分析多樣性指數(shù),結(jié)果見表3。

稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性分析結(jié)果顯示,早、晚稻不同施加處理共8個樣品的產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)構(gòu)建的克隆文庫覆蓋率均在87.50% 以上,說明覆蓋程度較高,文庫比較真實代表該稻田土壤中產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性。對照、爐渣、生物炭和混施處理的早稻土壤產(chǎn)甲烷菌的香農(nóng)-威納指數(shù)(H′)分別為2.55、2.56、2.60和2.79；4種處理的晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌的香農(nóng)-威納指數(shù)(H′)分別為2.31、2.36、2.69和2.98。由此可知,施加處理的稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性高于對照,尤生物炭和混施處理為明顯。

圖3 mcrA基因陽性克隆子的MspⅠ酶切圖譜(部分)Fig.3 mcrA genes of positive clones digested by MspⅠ(partial)

比較不同處理的辛普森指數(shù)(D)可知(表3),對照、爐渣、生物炭和混施處理的早稻土壤產(chǎn)甲烷菌的辛普森指數(shù)(D)分別為0.096、0.082、0.093和0.063；4種處理的晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌的辛普森指數(shù)(D)分別為0.165、0.153、0.076和0.061。施加處理的早、晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌辛普森指數(shù)(D)均低于對照,說明施加處理降低了產(chǎn)甲烷菌物種的均勻度。綜合香農(nóng)-威納指數(shù)(H′)和辛普森指數(shù)(D)可知,施加處理提高了稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的多樣性,并降低了產(chǎn)甲烷菌物種的均勻度。

表3 施加處理稻田土壤克隆文庫的多樣性分析

2.4 產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)酶切分類結(jié)果,分別將早稻樣品79個OTUs和晚稻樣品86個OTUs的克隆子接入LB液體培養(yǎng)基,將單克隆菌液送上海生工生物工程股份有限公司(Sangon)測序分析,將測定所得的序列與GenBank中已知序列進(jìn)行相似性比對。比對結(jié)果顯示,不同酶切圖譜類型的克隆子可能代表同一個屬,克隆子與GenBank數(shù)據(jù)中產(chǎn)甲烷菌mcrA序列相似性范圍在87%—99%之間,并且90%以上是不可培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌。將早稻、晚稻各4個處理的測序結(jié)果用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4、圖5可知,早稻土壤產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)共鑒定出6個菌屬,晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)共鑒定出8個菌屬,歸屬于甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)和Methanomassiliicoccales等6個類群。其中甲烷微菌目是優(yōu)勢類群,包括Methanoregula、甲烷囊菌屬(Methanoculleus)、甲烷螺菌屬(Methanospirillum)和產(chǎn)甲烷菌屬(Methanogenium)等4個菌屬。此外,本研究檢測到的甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)屬于甲烷桿菌目,甲烷球菌屬(Methanococcus)屬于甲烷球菌目,甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)屬于甲烷八疊球菌目,Methanocella屬于甲烷胞菌目,Methanomassiliicoccus屬于Methanomassiliicoccales。

圖4 施加處理早稻土壤產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of methanogens under different amendments in early paddy fieldsE：早稻Early paddy fields,L：晚稻 Late paddy fields,C：對照Control,S：爐渣Slag,B：生物炭 Biochar,SB：混施 Slag and Biochar;圖中編號表示克隆子編號

圖5 施加處理晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of methanogens under different amendments in late paddy fields

2.5 施加處理稻田土壤產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)群落組成

用堆積圖表示相對豐度在1.00%以上的產(chǎn)甲烷菌菌屬,早、晚稻不同施加處理下稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的群落組成如圖6和圖7所示。由圖6可知,早稻土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成的6個菌屬中,Methanoregula為優(yōu)勢菌屬,其相對豐度在對照、爐渣、生物炭和混施處理稻田土壤樣品中：分別占52.69%、50.00%、72.09%和57.89%。晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成的8個菌屬中(圖7),Methanoregula菌屬在4種處理的土壤樣品中其相對豐度分別占38.73%、38.68%、47.61%和30.47%。結(jié)合圖6和圖7可知,本研究稻田土壤檢測到的產(chǎn)甲烷菌菌屬有Methanoregula、甲烷囊菌屬(Methanoculleus)、甲烷螺菌屬(Methanospirillum)、產(chǎn)甲烷菌屬(Methanogenium)、Methanomassiliicoccus、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)和Methanocella等10個菌屬。

3 討論

3.1 稻田土壤產(chǎn)甲烷菌類群

近年來,產(chǎn)甲烷菌被分為4綱、7目、14科、35屬[40]。本研究在稻田土壤中檢測到6個目,包括甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)和Methanomassiliicoccales。其中占優(yōu)勢的類群是Methanomicrobiales(49.57%—79.06%),其次是Methanocellales(10.32%—33.63%)和Methanobacteriales(2.32%—25.00%)。該研究結(jié)果與前人報道基本一致[23,41- 42]。甲烷火菌目(Methanopyrales)是甲烷嗜高熱菌[43],研究學(xué)者在高緯度北極凍土區(qū)土壤和深海熱液中發(fā)現(xiàn)存在少部分該類群[44- 45],本研究在稻田土壤中沒有檢測到。從屬水平的群落結(jié)構(gòu)來看,本研究結(jié)果顯示稻田土壤中產(chǎn)甲烷優(yōu)勢菌屬主要有Methanoregula(30.47%—72.30%)、Methanocella(10.32%—33.63%)和Methanobacterium(0.85%—25.00%),這與先前在其他稻田土壤檢出的產(chǎn)甲烷菌類群基本一致[19,22,25,46]。由于生態(tài)環(huán)境各異,可能導(dǎo)致土壤中產(chǎn)甲烷菌群落的類群不盡相同,例如Lee等[24]在美國稻田土壤中還檢測到Methanosphaerula和Methanohalobium,Liu等[47]在中國稻田土壤中還檢測到Methanolinea和Methanomethylovorans。另一方面,產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)在水稻不同生育時期也會發(fā)生變化,Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)Methanocella、Methanosarcina和Methanobacterium是稻田土壤的優(yōu)勢類群,其在揚(yáng)花期和抽穗期(60d和90d)相對豐度最大；Methanococcus和Candidatus_Methanoregula在移栽120d后的相對豐度最大,但在移栽150d后沒有檢測到這兩種類群。Ke等[17]研究發(fā)現(xiàn)稻田土壤中產(chǎn)甲烷菌優(yōu)勢類群主要是Methanosarcinaceae(相對豐度約占60%),而在移栽50d后檢測到稻田土壤的主要類群為Methanomicrobiales。比較早、晚稻拔節(jié)期土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成可知(圖6和圖7),氫營養(yǎng)型的甲烷囊菌屬(Methanoculleus)是晚稻土壤的特有菌屬。氫營養(yǎng)型的Methanoculleus通常利用 H2/CO2、甲酸鹽生成CH4,而不利用乙酸和甲基胺生成CH4。由于早、晚稻生長季期間的氣候差異使得早稻土壤的甲烷囊菌屬(Methanoculleus)相對豐度較小,因此該類群在早稻土壤中尚未被檢測到。

3.2 施加處理條件下土壤理化性質(zhì)對稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

由早稻、晚稻拔節(jié)期土壤理化性質(zhì)可知(表1),爐渣、生物炭和混施處理提高了土壤pH,主要是因為生物炭含有堿性基團(tuán),能夠中和土壤中的質(zhì)子[48],爐渣含有Ca2+等堿性陽離子施入土壤后可提高土壤 pH[49]。有研究指出,較低pH值不適宜涉及CH4代謝的微生物菌群生長[50],CH4產(chǎn)生環(huán)境中對產(chǎn)甲烷菌適宜的pH值范圍是6.9—7.2[51]。因此土壤環(huán)境因素如pH、土壤溫度和底物供應(yīng)等均會影響產(chǎn)甲烷活性或產(chǎn)甲烷菌群落多樣性,直接或間接影響CH4產(chǎn)生。從對照組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)來看(表3),晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜性要低于早稻,此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[52]。由表1可知,對照組早稻土壤的pH和含水量分別為6.33、59.51%,而晚稻土壤的pH和含水量分別為6.08、51.34%。由此可見,經(jīng)歷了早稻生長季之后,土壤pH降低,植物體生長和微生物代謝消耗了部分土壤碳源、氮源(對照組的土壤有機(jī)碳含量從16.96mg/g下降到15.70mg/g,全氮含量從2.02mg/g 下降到1.93mg/g)。因此土壤微生物可利用底物下降,使得產(chǎn)甲烷菌可能受碳源供應(yīng)不足的限制而形成明顯的種間競爭,導(dǎo)致多樣性有所下降。

圖6 施加處理早稻土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成 Fig.6 Methanogenic community composition under different amendments in early paddy fields

圖7 施加處理晚稻土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成 Fig.7 Methanogenic community composition under different amendments in late paddy fields

由表1可知,生物炭和混施處理均提高了稻田土壤有機(jī)碳含量和碳氮比值,許欣等[53]也發(fā)現(xiàn)施加生物炭能提高土壤有機(jī)碳含量和碳氮比值。由于生物炭中的碳大多以穩(wěn)定芳香環(huán)不規(guī)則疊層堆積存在,具有高度的化學(xué)和微生物惰性,施進(jìn)土壤后難以被土壤微生物利用[54],本課題組研究發(fā)現(xiàn)生物炭和混施處理會減少稻田土壤細(xì)菌數(shù)量、增加土壤真菌/細(xì)菌比值[34]。因此生物炭和混施處理可通過影響土壤微生物活動從而刺激土壤碳循環(huán),影響產(chǎn)甲烷菌的多樣性。比較施加處理香農(nóng)-威納指數(shù)(H′)可知(表3),早、晚稻生長季,3種施加處理的稻田土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性在不同程度上高于對照組,生物炭、混施較為明顯。由此可見,生物炭和混施處理提高了土壤有機(jī)碳含量和碳氮比值,通過影響細(xì)菌、真菌等微生物生長繁殖進(jìn)而影響土壤碳、氮循環(huán),改變土壤原有產(chǎn)甲烷菌群落組成,引起土壤產(chǎn)甲烷菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,改變主要類群甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷桿菌目(Methanobacteriales)的相對豐度,從而增加產(chǎn)甲烷菌的多樣性。

3.3 施加處理條件下土壤理化性質(zhì)對稻田產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

由圖6和圖7的稻田土壤產(chǎn)甲烷菌群落組成可知,爐渣施加提高了Methanococcus的相對豐度、降低了Methanomassiliicoccus的相對豐度；生物炭處理提高了Methanoregula的相對豐度、降低了Methanosarina的相對豐度。由此可見,不同的廢棄物及其施用量對稻田產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的影響并不相同。一方面施加物通過影響土壤理化性質(zhì)從而改變土壤微生物菌群,另一方面,施加物的自身性質(zhì)(如生物炭的穩(wěn)定性、爐渣的氧化鐵等成分)影響了稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的群落組成。由表1的土壤理化性質(zhì)可知,施加處理在不同程度上提高了土壤鹽度,這主要是因為生物炭和爐渣含有鉀、鈣、鎂、鐵等元素；爐渣還含有大量活性氧化鐵,這些物質(zhì)施加后將提高了土壤鹽度。研究指出鹽度的增加會抑制產(chǎn)甲烷菌Methanocellaceae的活性[21],鹽度的增大還可能影響厭氧發(fā)酵過程中電子受體的供應(yīng),導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌可利用底物發(fā)生變化從而影響產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)[55]。因此施加生物炭、爐渣等廢棄物,可通過提高土壤鹽度,使產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。與對照相比,3種施加處理均降低了早稻土壤Methanomassiliicoccus的相對豐度。Methanomassiliicoccus屬于甲基型產(chǎn)甲烷古菌,缺少將CO2還原為甲基輔酶M的完整路徑[56]。有研究發(fā)現(xiàn)Fe3+可直接抑制CH4的生成,影響產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)CH4的作用[57]。爐渣含有的氧化鐵作為電子受體,競爭H2或甲醇、甲胺類物質(zhì)底物,因此不利于Methanomassiliicoccus的生長。本課題組研究發(fā)現(xiàn)施加處理能降低稻田CH4的排放通量[34],由此可見,施加處理可通過提高土壤鹽度、改變產(chǎn)甲烷菌可利用底物,降低Methanomassiliicoccus的相對豐度從而引起CH4產(chǎn)生量的減少。此外我們還發(fā)現(xiàn)生物炭施加降低了Methanosarcina的相對豐度。Methanosarcina和Methanosaeta是兩種乙酸營養(yǎng)途徑的產(chǎn)甲烷菌,有研究發(fā)現(xiàn),理論上67%的CH4由乙酸的脫甲基途徑產(chǎn)生[58]。由于生物炭高度穩(wěn)定,不易被微生物降解產(chǎn)生乙酸等產(chǎn)CH4的前體物質(zhì),因此不利于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長。研究指出Methanosarcina的甲烷產(chǎn)生潛力極大[25- 26,59],Bao等[22]還發(fā)現(xiàn)Methanosarcinaceae的相對豐度與CH4產(chǎn)生呈正相關(guān)；由此可見Methanosarcina占土壤產(chǎn)CH4微生物的比例下降對稻田CH4排放的影響較大。因此施加生物炭可通過影響土壤碳氮含量、降低產(chǎn)甲烷菌Methanosarcina的相對豐度,從而達(dá)到減少稻田CH4排放的效果。

3.4 爐渣與生物炭單施與配施效應(yīng)比較

本文不僅研究了單一施加處理的作用,還進(jìn)一步探討了爐渣與生物炭二者配施的效應(yīng),結(jié)果顯示將生物炭與爐渣混合施加,CH4的減排效果優(yōu)于單一施加[34],說明混合施加具有明顯的增強(qiáng)作用。由表1土壤理化性質(zhì)可知,與爐渣或生物炭單一施加處理相比,混施處理的土壤鹽度、pH、土壤有機(jī)碳含量、全氮含量以及碳氮比值最高,說明混合施加對土壤理化性質(zhì)影響較大。而且,混施處理產(chǎn)甲烷菌多樣性也高于單一施加處理(表3)?；旌鲜┘犹幚肀憩F(xiàn)出較好的減排效果,分析原因認(rèn)為與生物炭和爐渣配合施加綜合了2種材料的特性有關(guān),也可能與施加量有關(guān),因為混合施加處理的施加量是單一施加的2倍(爐渣和生物炭各8t/hm2,總計16t/hm2)。施加量不同是否產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步的研究,目前本課題組正在進(jìn)行此項工作。

4 結(jié)論

(1) 早稻拔節(jié)期,混施處理顯著提高土壤鹽度、pH；晚稻拔節(jié)期,混施處理顯著提高土壤鹽度,爐渣和混施處理顯著提高pH。早、晚稻拔節(jié)期,生物炭和混施處理提高土壤有機(jī)碳含量、碳氮比值。

(2) 與對照相比,生物炭、爐渣和混合施加這3種處理均提高了稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的多樣性,并降低了產(chǎn)甲烷菌物種的均勻度。

(3) 本研究的稻田土壤產(chǎn)甲烷菌主要有6大類群：甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)和Methanomassiliicoccales；其中優(yōu)勢類群為甲烷微菌目(Methanomicrobiales)。優(yōu)勢菌屬主要是Methanoregula、Methanocella和Methanobacterium。

(4) 與對照相比,爐渣、生物炭和混施處理均降低了早稻土壤Methanomassiliicoccus相對豐度；生物炭處理還降低了Methanosarcina相對豐度；施加處理影響土壤理化性質(zhì)如提高土壤鹽度、土壤有機(jī)碳含量和碳氮比值,使得產(chǎn)甲烷菌群落組成發(fā)生改變,可能是其降低CH4排放通量的原因之一。

參考文獻(xiàn)(References):

[1] Bridgham S D, Cadillo-Quiroz H, Keller J K, Zhuang Q L. Methane emissions from wetlands: biogeochemical, microbial, and modeling perspectives from local to global scales. Global Change Biology, 2013, 19(5): 1325- 1346.

[2] IPCC. Climate Change 2013: the Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA: Cambridge University Press, 2013: 1535.

[3] Conrad R. The global methane cycle: recent advances in understanding the microbial processes involved. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1(5): 285- 292.

[4] Ali M A, Sattar M A, Islam M N, Inubushi K. Integrated effects of organic, inorganic and biological amendments on methane emission, soil quality and rice productivity in irrigated paddy ecosystem of Bangladesh: field study of two consecutive rice growing seasons. Plant and Soil, 2014, 378(1/2): 239- 252.

[5] Turmel M S, Speratti A, Baudron F, Verhulst N, Govaerts B. Crop residue management and soil health: a systems analysis. Agricultural Systems, 2015, 134: 6- 16.

[6] Susilawati H L, Setyanto P, Makarim A K, Ariani M, Ito K, Inubushi K. Effects of steel slag applications on CH4, N2O and the yields of Indonesian rice fields: a case study during two consecutive rice-growing seasons at two sites. Soil Science and Plant Nutrition, 2015, 61(4): 704- 718.

[7] Hu N J, Wang B J, Gu Z H, Tao B R, Zhang Z W, Hu S J, Zhu L Q, Meng Y L. Effects of different straw returning modes on greenhouse gas emissions and crop yields in a rice-wheat rotation system. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2016, 223: 115- 122.

[8] Wu M X, Han X G, Zhong T, Yuan M D, Wu W X. Soil organic carbon content affects the stability of biochar in paddy soil. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2016, 223: 59- 66.

[9] Wang J Y, Pan X J, Liu Y L, Zhang X L, Xiong Z Q. Effects of biochar amendment in two soils on greenhouse gas emissions and crop production. Plant and Soil, 2012, 360(1/2): 287- 298.

[10] Zheng J F, Chen J H, Pan G X, Liu X Y, Zhang X F, Li L Q, Bian R J, Cheng K, Zheng J W. Biochar decreased microbial metabolic quotient and shifted community composition four years after a single incorporation in a slightly acid rice paddy from southwest China. Science of the Total Environment, 2016, 571: 206- 217.

[11] Zhang A F, Bian R J, Pan G X, Cui L Q, Hussain Q, Li L Q, Zheng J W, Zheng J F, Zhang X H, Han X J, Yu X Y. Effects of biochar amendment on soil quality, crop yield and greenhouse gas emission in a Chinese rice paddy: a field study of 2 consecutive rice growing cycles. Field Crops Research, 2012, 127: 153- 160.

[12] Tong H, Hu M, Li F B, Chen M J. Biochar enhances the microbial and chemical transformation of pentachlorophenol in paddy soil. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 70: 142- 150.

[13] Qian L, Chen L, Joseph S, Pan G X, Li L Q, Zheng J W, Zhang X H, Zheng J F, Yu X Y, Wang J F. Biochar compound fertilizer as an option to reach high productivity but low carbon intensity in rice agriculture of China. Carbon Management, 2014, 5(2): 145- 154.

[14] Wang N, Chang Z Z, Xue X M, Yu J G, Shi X X, Ma L Q, Li H B. Biochar decreases nitrogen oxide and enhances methane emissions via altering microbial community composition of anaerobic paddy soil. Science of the Total Environment, 2017, 581- 582: 689- 696.

[15] Wang W Q, Lai D Y F, Li S C, Kim P J, Zeng C S, Li P F, Liang Y C. Steel slag amendment reduces methane emission and increases rice productivity in subtropical paddy fields in China. Wetlands Ecology and Management, 2014, 22(6): 683- 691.

[16] Scavino A F, Ji Y, Pump J, Klose M, Claus P, Conrad R. Structure and function of the methanogenic microbial communities in Uruguayan soils shifted between pasture and irrigated rice fields. Environmental Microbiology, 2013, 15(9): 2588- 2602.

[17] Ke X B, Lu Y H, Conrad R. Different behaviour of methanogenic archaea andThaumarchaeotain rice field microcosms. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 87(1): 18- 29.

[18] Seo J, Jang I, Gebauer G, Kang H. Abundance of methanogens, methanotrophic bacteria, and denitrifiers in rice paddy soils. Wetlands, 2014, 34(2): 213- 223.

[19] Liu D Y, Ishikawa H, Nishida M, Tsuchiya K, Takahashi T, Kimura M, Asakawa S. Effect of paddy-upland rotation on methanogenic archaeal community structure in paddy field soil. Microbial Ecology, 2015, 69(1): 160- 168.

[20] Liu Y, Liu X Y, Cheng K, Li L Q, Zhang X H, Zheng J F, Zheng J W, Pan G X. Responses of methanogenic and methanotrophic communities to elevated atmospheric CO2and temperature in a paddy field. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1895.

[21] Peng J J, Wegner C E, Liesack W. Short-term exposure of paddy soil microbial communities to salt stress triggers different transcriptional responses of key taxonomic groups. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 400.

[22] Bao Q L, Xiao K Q, Chen Z, Yao H Y, Zhu Y G. Methane production and methanogenic archaeal communities in two types of paddy soil amended with different amounts of rice straw. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 88(2): 372- 385.

[23] Zhou B B, Wang Y M, Feng Y Z, Liu X G. The application of rapidly composted manure decreases paddy CH4emission by adversely influencing methanogenic archaeal community: a greenhouse study. Journal of Soils and Sediments, 2016, 16(7): 1889- 1900.

[24] Lee H J, Kim S Y, Kim P J, Madsen E L, Jeon C O. Methane emission and dynamics of methanotrophic and methanogenic communities in a flooded rice field ecosystem. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 88(1): 195- 212.

[25] Dubey S K, Singh A, Watanabe T, Asakawa S, Singla A, Arai H, Inubushi K. Methane production potential and methanogenic archaeal community structure in tropical irrigated Indian paddy soils. Biology and Fertility of Soils, 2014, 50(2): 369- 379.

[26] Nguyen S G, Guevarra R B, Kim J, Ho C T, Trinh M V, Unno T. Impacts of initial fertilizers and irrigation systems on paddy methanogens and methane emission. Water, Air, & Soil Pollution, 2015, 226: 309.

[27] 董達(dá). 生物質(zhì)炭對水稻生長與稻田甲烷排放效應(yīng)的影響及其機(jī)理研究. 杭州: 浙江大學(xué), 2015: 15- 23.

[28] Liu Y X, Yang M, Wu Y M, Wang H L, Chen Y X, Wu W X. Reducing CH4and CO2emissions from waterlogged paddy soil with biochar. Journal of Soils and Sediments, 2011, 11(6): 930- 939.

[29] Dong D, Yang M, Wang C, Wang H L, Li Y, Luo J F, Wu W X. Responses of methane emissions and rice yield to applications of biochar and straw in a paddy field. Journal of Soils and Sediments, 2013, 13(8): 1450- 1460.

[30] Han X G, Xue S, Wang C, Wu M X, Dong D, Zhong T, Thies J E, Wu W X. Mitigating methane emission from paddy soil with rice-straw biochar amendment under projected climate change. Scientific Reports, 2016, 6: 24731.

[31] Feng Y Z, Xu Y P, Yu Y C, Xie Z B, Lin X G. Mechanisms of biochar decreasing methane emission from Chinese paddy soils. Soil Biology and Biochemistry, 2012, 46: 80- 88.

[32] Wang W, Sardans J, Lai D Y F, Wang C, Zeng C, Tong C, Liang Y, Peuelas J. Effects of steel slag application on greenhouse gas emissions and crop yield over multiple growing seasons in a subtropical paddy field in China. Field Crops Research, 2015, 171: 146- 156.

[33] Singla A, Inubushi K. Effect of slag-type fertilizers on N2O flux from komatsuna vegetated soil and CH4flux from paddy vegetated soil. Paddy and Water Environment, 2015, 13(1): 43- 50.

[34] 王妙瑩, 許旭萍, 王維奇, 王廣磊, 蘇程舉, 安婉麗. 爐渣與生物炭施加對稻田溫室氣體排放及其相關(guān)微生物影響. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2017, 37(3): 1046- 1056.

[35] 馬永躍, 仝川, 王維奇, 曾從盛. 浮萍對福州平原稻田CH4和N2O排放的影響分析. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 20(6): 723- 727.

[36] 烏英嗄. 生物質(zhì)炭施用對華北潮土土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性的影響. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古師范大學(xué), 2014: 5- 6.

[37] 佘晨興, 仝川. 閩江口蘆葦沼澤濕地土壤產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的垂直分布. 生態(tài)學(xué)報, 2012, 32(17): 5299- 5308.

[38] 曾志華, 楊民和, 佘晨興, 仝川. 閩江河口區(qū)淡水和半咸水潮汐沼澤濕地土壤產(chǎn)甲烷菌多樣性. 生態(tài)學(xué)報, 2014, 34(10): 2674- 2681.

[39] Hill T C J, Walsh K A, Harris J A, Moffett B F. Using ecological diversity measures with bacterial communities. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 43(1): 1- 11.

[40] 王保玉, 劉建民, 韓作穎, 劉健, 胡斌. 產(chǎn)甲烷菌的分類及研究進(jìn)展. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2014, 33(2): 418- 425.

[41] Lu Y, Fu L, Lu Y H, Hugenholtz F, Ma K. Effect of temperature on the structure and activity of a methanogenic archaeal community during rice straw decomposition. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 81: 17- 27.

[42] Liu H F, Wu X, Li Z S, Wang Q, Liu D, Liu G H. Responses of soil methanogens, methanotrophs, and methane fluxes to land-use conversion and fertilization in a hilly red soil region of southern China. Environmental Science and Pollution Research, 2017, 24(9): 8731- 8743.

[43] 傅霖, 辛明秀. 產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)多樣性及工業(yè)應(yīng)用. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2009, 15(4): 574- 578.

[44] Roussel E G, Konn C, Charlou J L, Donval J P, Fouquet Y, Querellou J, Prieur D, Bonavita M A C. Comparison of microbial communities associated with three Atlantic ultramafic hydrothermal systems. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 77(3): 647- 665.

[45] Allan J, Ronholm J, Mykytczuk N C S, Greer C W, Onstott T C, Whyte L G. Methanogen community composition and rates of methane consumption in Canadian High Arctic permafrost soils. Environmental Microbiology Reports, 2014, 6(2): 136- 144.

[46] Xu J L, Zhuang L, Yang G Q, Yuan Y, Zhou S G. Extracellular Quinones affecting methane production and methanogenic community in paddy soil. Microbial Ecology, 2013, 66(4): 950- 960.

[47] Liu J N, Xu H S, Jiang Y, Zhang K, Hu Y G, Zeng Z H. Methane emissions and microbial communities as influenced by dual cropping ofAzollaalong with early rice. Scientific Reports, 2017, 7: 40635.

[48] Mazej D, Falnoga I, Veber M, Stibilj V. Determination of selenium species in plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS. Talanta, 2006, 68(3): 558- 568.

[49] Ali M A, Lee C H, Kim P J. Effect of silicate fertilizer on reducing methane emission during rice cultivation. Biology and Fertility of Soils, 2008, 44(4): 597- 604.

[50] Dunfield P, Knowles R, Dumont R, Moore T R. Methane production and consumption in temperate and subarctic peat soils: response to temperature and pH. Soil Biology and Biochemistry, 1993, 25(3): 321- 326.

[51] Wang Z P, Lindau C W, Delaune R D, Jr P W H. Methane emission and entrapment in flooded rice soils as affected by soil properties. Biology and Fertility of Soils, 1993, 16(3): 163- 168.

[52] 李大明, 成艷紅, 劉滿強(qiáng), 秦江濤, 焦加國, 李輝信, 胡鋒. 雙季稻田甲烷排放與土壤產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量關(guān)系研究. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2013, 32(4): 866- 873.

[53] 許欣, 陳晨, 熊正琴. 生物炭與氮肥對稻田甲烷產(chǎn)生與氧化菌數(shù)量和潛在活性的影響. 土壤學(xué)報, 2016, 53(6): 1517- 1527.

[54] Pan F X, Li Y Y, Chapman S J, Khan S, Yao H Y. Microbial utilization of rice straw and its derived biochar in a paddy soil. Science of the Total Environment, 2016, 559: 15- 23.

[55] 康晏, 王萬春, 任軍虎. 生物氣生成的地球化學(xué)因素分析. 礦物巖石地球化學(xué)通報, 2004, 23(4):350- 354.

[56] 張堅超, 徐鐿欽, 陸雅海. 陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過程的微生物機(jī)理. 生態(tài)學(xué)報, 2015, 35(20): 6592- 6603.

[57] Van Bodegom P M, Scholten J C M, Stams A J M. Direct inhibition of methanogenesis by ferric iron. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 49(2): 261- 268.

[58] Conrad R. Microbial ecology of methanogens and methanotrophs. Advances in Agronomy, 2007, 96: 1- 63.

[59] De Vrieze J, Hennebel T, Boon N, Verstraete W.Methanosarcina: the rediscovered methanogen for heavy duty biomethanation. Bioresource Technology, 2012, 112: 1- 9.