丁 見，吳 鋒，繆化春，李懷斌，熊克仁

(皖南醫(yī)學院 人體解剖學教研室，安徽 蕪湖 241002)

腦缺血是臨床常見疾病，具有高致殘率、高病死率的特點，其病理過程較為復雜，缺血病灶區(qū)局部甚至遠離缺血區(qū)部位都會出現(xiàn)不同程度的損傷[1]。大腦內不同部位對缺血缺氧損害敏感程度有差異，海馬是其中較為敏感的部位，也是大腦內具有重要功能的結構[2]。針刺作為中國傳統(tǒng)的“非藥物”治療手段，對腦缺血后神經、血管再生具有顯著的臨床效應[3]。神經生長因子(nerve growth factor,NGF)和生長休止特定蛋白7(growth arrest-specific protein 7,Gas7)對中樞神經系統(tǒng)的再生和修復有著重要的作用，具有維持神經元存活、參與受損神經元修復等功能[4-5]。前期研究顯示，電針可通過上調大鼠缺血側丘腦腹后外側核NGF和Gas7的表達，從而對神經元起到一定保護作用[6]，但電針對海馬CA3區(qū)NGF和Gas7表達的影響尚未見報道。本研究通過建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，觀察電針刺激“百會”和左側“足三里”穴對腦缺血損傷后海馬CA3區(qū)NGF和Gas7表達的影響，探討電針對大鼠腦缺血后損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠24只，清潔級成年雄性，體質量(200±20)g，許可證號：SCXK(蘇)2014-0007。適應性飼養(yǎng)7 d后，大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和電針組，每組6只。

1.2 藥品及試劑 戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；NGF一抗，北京博奧森生物技術有限公司；Gas7一抗，Santa Cruz公司；濃縮型SABC-POD試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；PBS漂洗緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司；多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)，武漢博士德生物工程有限公司；DAB底物顯色試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.3 模型制備 參照本研究前期建立的MCAO模型制作方法[6]，大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后仰臥于實驗臺上，頸部剃毛、消毒后做正中切口，分離出右側頸總動脈(CCA)，分離頸外動脈(ECA) 、頸內動脈(ICA) 顱外段。將CCA近心端結扎，ECA結扎。于右側頸總動脈近分叉處作一小切口，插入預先準備的直徑0.26 mm尼龍線，深度(18.5±0.5)mm，用備線扎緊，清創(chuàng)，縫合皮膚。同時制備假手術組作為對照，僅暴露右側CCA、ECA及ICA，逐層縫合，正常進水進食。

1.4 干預方法 造模成功1周后，電針組參照中國針灸學會實驗針灸委員會制定的實驗動物穴位圖譜，以30號1寸毫針取“百會”穴斜刺入頭皮1 mm，直刺左側“足三里”穴2 mm。針柄連接至電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號：SDZ-Ⅱ)，給予低頻(2 Hz) 電流刺激，強度為2 V，波寬為1 ms，持續(xù)30 min，每日1次，連續(xù)3周。其余3組不予干預。

1.5 標本采集與形態(tài)學檢測 以1% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸，用插管經左心室-升主動脈灌注4%多聚甲醛，灌注后取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜[7]進行分段，將分段后的腦組織放入4%甲醛固定24 h后石蠟包埋。常規(guī)石蠟切片(厚5 μm)，以涂有多聚賴氨酸的載玻片貼片后按SABC免疫組織化學染色試劑盒步驟進行操作，DAB顯色，中性樹膠封片。切片中選取相同冠狀切面，每組10張，在光學顯微鏡采用400倍視野對CA3區(qū)進行觀察拍照，采集照片相同區(qū)域內用Image J 軟件對NGF和Gas7陽性神經細胞進行計數并測量平均灰度值。

2 結果

2.1 神經元形態(tài)學比較 正常組及假手術組CA3區(qū)尼氏染色后鏡下結構境界清晰，淡染，排列較為整齊，神經元形態(tài)完整，胞核居中，胞質豐富。模型組大鼠患側海馬錐體細胞層次減少、排列紊亂，神經細胞形態(tài)不規(guī)則增多。電針組大鼠神經元細胞形態(tài)有改善，缺血側細胞萎縮狀況較模型組減少(見圖1)。

A.正常組；B.假手術組；C.模型組；D.電針組。

圖1 各組大鼠右側海馬CA3區(qū)神經元尼氏染色

2.2 NGF蛋白在各組右側海馬CA3區(qū)表達的比較 各組大鼠右側海馬CA3區(qū)均有NGF的表達。NGF免疫陽性產物主要著色部位為神經元的胞膜與胞質，陽性神經元著色呈棕黃色。正常組可見少許淡染的NGF陽性神經元；模型組CA3區(qū)NGF陽性神經元數量增多(P<0.01)，染色加深，細胞平均灰度值較正常組降低(P<0.01)；電針組與模型組比較，CA3區(qū)NGF陽性神經元數量均增多(P<0.01)，免疫陽性細胞平均灰度值降低(P<0.01)；與正常組比較，假手術組右側CA3區(qū)NGF陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1、圖2。

與正常組比較aP<0.01;與模型組比較bP<0.01;與正常組比較 cP>0.05。

A.正常組；B.假手術組；C.模型組；D.電針組。

圖2 NGF在大鼠右側海馬CA3區(qū)的表達

2.3 Gas7蛋白在各組右側海馬CA3區(qū)表達的比較 Gas7陽性神經元呈棕黃色，著色部位主要為胞膜和胞質，細胞多呈圓形，少數呈橢圓形。正常組CA3區(qū)可見少量淡染的Gas7陽性神經元。模型組Gas7陽性細胞數較正常組增多(P<0.01)，細胞染色加深，細胞平均灰度值降低(P<0.01)；電針組Gas7陽性神經元呈深染狀態(tài)，與模型組比較，細胞數增多(P<0.01)，平均灰度值降低(P<0.01)；與正常組相比較，假手術組CA3區(qū)Gas7陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖3。

3 討論

缺血性腦血管病是臨床常見疾病，具有致殘率高的特點，嚴重威脅著人類的健康及生存質量，防治缺血性腦血管病一直是臨床關注的重點，也是目前醫(yī)學研究的熱點。針灸作為中醫(yī)學治療手段，受到各國臨床醫(yī)學界的高度重視，其可明顯改善腦缺血后神經功能損害癥狀，提高患者生活質量，現(xiàn)已廣泛應用于腦缺血后的治療[8]。傳統(tǒng)觀念認為，中樞神經系統(tǒng)損傷后不能修復，但人們近年對神經干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，在海馬終身存在著內源性神經干細胞，腦損傷可刺激體內神經再生區(qū)的神經干細胞増殖、分化，進行自我修復。但大腦的自身修復能力有限，而電針可通過改善機體血氧代謝方面對腦缺血起治療作用[9]，發(fā)揮延緩腦損傷的保護作用，使大腦神經的功能和形態(tài)損害減輕。本研究探討腦缺血后電針“百會”、“足三里”穴對腦的保護作用并研究其中可能的作用機制。通過尼氏染色觀察到模型組大鼠患側海馬CA3區(qū)神經元出現(xiàn)損傷，以此驗證了模型的成功與穩(wěn)定性，可以用于研究電針對MCAO模型大鼠海馬CA3區(qū)NGF和Gas7表達的影響。通過為期21 d的電針干預治療以后，電針組大鼠缺血區(qū)神經元萎縮狀況明顯好轉，說明電針具有較好的良性調節(jié)作用，可在一定程度上減少腦缺血對神經元帶來的損害。

A.正常組；B.假手術組；C.模型組；D.電針組。

圖3 Gas7在大鼠右側海馬CA3區(qū)的表達

神經干細胞終身存在于哺乳動物腦內，腦缺血缺氧后神經細胞存在一定的自身保護機制，機體可上調一些內源性神經營養(yǎng)因子的表達，降低腦神經細胞損傷程度。NGF是發(fā)現(xiàn)最早的一類神經營養(yǎng)因子，具有抗氧化、抗調亡、抑制興奮性氨基酸神經毒性等多種作用，可保護效應神經元，促使損傷神經再生。局灶性缺血損傷后NGF的表達會上調，參與神經元再生的調節(jié)。NGF是具有神經元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節(jié)因子，可促進缺血后神經元的存活和生長發(fā)育并能夠防止它們受損死亡，改善神經元的病理狀態(tài)，促進受損神經元再生及分化成熟，在損傷修復中具有重要作用[10]。大量研究表明，NGF對缺血缺氧導致的腦損傷具有保護作用，海馬是大腦內合成NGF的重要場所[11]。本課題組前期對局灶性腦缺血大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在海馬的缺血側出現(xiàn)了Nestin陽性神經元的增強表達，Nestin是神經干細胞的特征性標志物，在海馬區(qū)出現(xiàn)神經干細胞的增殖，說明具有一定的自身代償性修復作用。本實驗觀察到模型組大鼠缺血側海馬CA3區(qū)NGF的表達與正常組相比出現(xiàn)明顯增高，而NGF的高表達則可促進Nestin的表達，有利于缺血后海馬產生的神經干細胞增殖和分化。說明NGF的表達增高可促進腦缺血后大鼠的自身代償性修復，可以在一定程度上改善神經功能缺損狀況。

Gas7蛋白主要表達于腦組織，可調節(jié)神經細胞的生長分化，有報道顯示Gas7的高表達對缺氧造成的神經元受損有保護作用，在慢性復合應激模型可誘導海馬齒狀回的神經干細胞向神經細胞分化等，從多方面參與了神經系統(tǒng)的損傷修復。神經系統(tǒng)對缺血缺氧異常敏感，尤其在大腦皮質，在缺血缺氧環(huán)境下會最先出現(xiàn)損傷[12]，引起細胞受損甚至凋亡。海馬是大腦皮質邊緣系統(tǒng)的一部分，屬易受缺血影響的區(qū)域。既往研究表明Gas7在海馬的發(fā)生和發(fā)育過程中起重要作用[13]，本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)模型組海馬CA3區(qū)的Gas7蛋白表達明顯增高，說明缺血條件下可能激活了海馬CA3區(qū)Gas7基因的轉錄，使Gas7在CA3區(qū)蛋白合成增多。Gas7在模型組海馬CA3區(qū)的表達，提示其可能對缺血缺氧的CA3區(qū)神經元具有保護作用，促進受損神經元的修復。

有臨床研究顯示，針刺對改善腦梗塞患者的致殘率有較好療效，我室曾研究表明電針可通過顯著增加MCAO大鼠海馬CA3區(qū)Nestin和BDNF的表達誘導神經干細胞的增殖，從而對缺血后海馬具有保護作用[14]。本實驗對MCAO大鼠電針治療中選取“百會”和“足三里”兩穴位，“百會”歸屬督脈，與中樞神經系統(tǒng)有密切聯(lián)系；“足三里”穴與血管、神經等聯(lián)系密切。電針此二穴位，既可增強腦皮層興奮性，又可對遠隔部位起到明顯治療作用。實驗結果發(fā)現(xiàn)電針可上調MCAO模型大鼠CA3區(qū)NGF和Gas7的表達，結合既往電針對腦缺血后神經系統(tǒng)的保護及修復作用的相關資料，NGF和Gas7的表達上調可以促進內源性神經干細胞的增殖和分化，促進神經功能的進一步修復。在本實驗室前期的研究中發(fā)現(xiàn)電針可上調缺血側丘腦NGF和Gas7的表達，提示電針在腦缺血后對神經系統(tǒng)的保護是通過多個部位神經元的調控發(fā)揮作用的，本結果可為臨床上治療腦缺血提供一定的實驗依據，其分子機制有待今后進一步的研究。

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