王清富，朱立新，秦愛萍，陳鐵峰，李金盤,吳北太，余 曉，賴忠安，謝維雄

(1.茂名市電白區(qū)人民醫(yī)院 外一科,廣東 茂名 525000;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 血液科，廣東 廣州 510000)

骨肉瘤是兒童、青少年最常見的惡性骨腫瘤，目前對(duì)骨肉瘤的療效已經(jīng)有了顯著提高，但仍有30%以上的患者呈現(xiàn)局部的侵襲性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移情況[1]。近二十年來雖然新輔助化療和綜合治療不斷發(fā)展，但該病的病死率仍然居高不下。因此研究骨肉瘤轉(zhuǎn)移以及侵襲的分子機(jī)制對(duì)治療疾病和改善預(yù)后具有重要作用[2]。溶血磷脂酸(lyso-phosphotidic acid，LPA)是目前已知體內(nèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的水溶性甘油磷脂，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移能力，可促細(xì)胞骨架變化[3]?；贚PA的受體具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞黏附和遷移能力及LPA受體的基本功能，我們推斷LPA受體亦可能與骨肉瘤細(xì)胞的治療具有相關(guān)性，可能產(chǎn)生相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)[3]。有哪些胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子在介導(dǎo)肉瘤細(xì)胞向骨折部位定向黏附和遷移歸巢過程中起關(guān)鍵作用，目前尚不清楚[4]。而已有研究表明：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)在一定范圍內(nèi)影響?zhàn)じ胶瓦w移Mg-63的數(shù)量，即隨其濃度增加而增加[5]。隨著研究的不斷深入，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子及受體可能會(huì)成為腫瘤細(xì)胞黏附和遷移的重要靶標(biāo)因子，本項(xiàng)目選擇骨髓源性細(xì)胞Mg-63，探討應(yīng)用LPA受體和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)分子對(duì)Mg-63黏附和遷移的影響，從而為治療骨肉瘤提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要材料 細(xì)胞：骨肉瘤細(xì)胞Mg-63、正常成骨細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。材料：胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子SDF-1α、MCP-1(PeProtech，美國)；SB203580、AMD3100(Sigma，美國)；TaqMix(東盛生物公司，廣州，中國)；Transwell 24孔培養(yǎng)板(美國 Corning 公司，美國)，MTT試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京，中國)；LPA受體(PeProtech 公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清及雙抗培養(yǎng)Mg-63骨肉瘤細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2傳代培養(yǎng)。細(xì)胞密度70%以上進(jìn)行傳代，細(xì)胞消化后加入完全培養(yǎng)基，1000 r/min離心5 min，棄上清，計(jì)數(shù)接種。當(dāng)細(xì)胞傳至P3代進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組，治療組：運(yùn)用LPA受體干預(yù)的Mg-63細(xì)胞；模型組：未經(jīng)干預(yù)的Mg-63；對(duì)照組：正常成骨細(xì)胞。

1.2.3 Transwell體外檢測(cè)黏附和遷移實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 骨肉瘤細(xì)胞Mg-63體外黏附和遷移情況 取P3代Mg-63于細(xì)胞鋪板前1天，無血清培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)液混懸成密度為5×105/mL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)池Transwell置入24孔板中，加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于下室內(nèi)，上室內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液(約5×104細(xì)胞)。置于5% CO2，37℃孵箱培養(yǎng)24 h后，用棉球小心擦去上室內(nèi)細(xì)胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20～30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。500 μL 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液100 μL，加入培養(yǎng)板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

1.2.3.2 LPA受體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63黏附和遷移能力的影響 100 mg/L LPA培養(yǎng)基100 μL進(jìn)行培養(yǎng)，加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于下室內(nèi)，100 μL細(xì)胞懸液加入上室內(nèi)。結(jié)晶紫染色拍照，570 nm測(cè)定吸光值。

1.2.3.3 SDF-1α、MCP-1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63黏附和遷移能力的影響 按照上述分組方法，收集3組P3代細(xì)胞，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入不同濃度的SDF-1α、MCP-1(0、1、10、100 μg/L)[6]，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。結(jié)晶紫染色拍照，570 nm測(cè)定吸光值。

1.2.3.4 AMD3100、SB203580對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63黏附和遷移能力的影響 取3組P3代細(xì)胞在含特異性阻斷劑AMD3100、SB203580(5 mg/L)的培養(yǎng)基中置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，再按上述1.2.3.1方法，收集細(xì)胞，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入最佳濃度(100 μg/L)的SDF-1α、MCP-1，對(duì)照組不作任何處理，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。結(jié)晶紫染色拍照，570 nm測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果

2.1 LPA受體對(duì)骨肉細(xì)胞體外遷移的影響 Transwell結(jié)果顯示，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)按照(0.000、0.001、0.010、0.050、0.100 g/L)的濃度梯度，應(yīng)用LPA受體干預(yù)后不同作用時(shí)間與對(duì)照組相比較骨肉瘤細(xì)胞體外遷移能力加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 SDF-1α、MCP-1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63黏附和遷移能力的影響 Transwell體外黏附和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3組Mg-63在胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子SDF-1α、MCP-1誘導(dǎo)下，細(xì)胞黏附和遷移增多，且呈濃度依賴性，最佳濃度為100 μg/L(F=15.265，P<0.05)(圖1)。治療后第7天，治療組Mg-63在SDF-1α、MCP-1誘導(dǎo)下與模型組、對(duì)照組相比，表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附和遷移能力(F=13.658，P<0.05)。各組治療后第14天，Mg-63黏附和遷移能力均有所下降，但在SDF-1α、MCP-1誘導(dǎo)下，治療組與模型組、對(duì)照組相比，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.765，P<0.05)，模型組與對(duì)照組相比，在MCP-1誘導(dǎo)下兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.053，P>0.05)。各組治療后第21天Mg-63細(xì)胞的黏附和遷移能力下降，但在最佳濃度SDF-1α、MCP-1誘導(dǎo)下，治療組與模型組、對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.382，P<0.05)。模型組在SDF-1α誘導(dǎo)下，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.085，P>0.05)。

表1 LPA受體對(duì)骨肉細(xì)胞體外遷移的影響

給藥濃度/(g/L)遷徙率/%0 h2 h4 h6 h8 hFP0.0005.45±2.175.64±2.496.35±2.386.65±3.115.42±2.540.0500.8280.00117.56±5.64*36.63±8.93*45.56±9.92*55.47±7.85*65.66±11.49*9.4510.0150.01034.34±10.29*45.63±11.67*58.63±10.83*68.57±10.55*74.63±10.52*14.9300.0050.05059.63±17.52*63.66±15.26*70.56±12.42*83.53±9.62*89.83±7.84*11.7950.0090.10077.64±19.21*81.43±16.59*86.93±10.49*92.46±5.47*97.83±1.23*11.5950.009F9.00910.39111.44012.31112.942P0.0170.0120.0100.0080.007

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05。

1.對(duì)照組；2.模型組；3.治療組。

圖1 胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子SDF-1α、MCP-1對(duì)Mg-63黏附和遷移能力的影響

2.3 AMD3100、SB203580對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63黏附和遷移能力的影響 Transwell體外黏附和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時(shí)相Mg-63經(jīng)SDF-1α特異性受體阻斷劑AMD3100處理后，Mg-63黏附和遷移數(shù)量下降，與SDF-1α組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.163，P<0.05)(圖2)。同樣，不同時(shí)相Mg-63經(jīng)MCP-1特異性阻斷劑SB203580處理后，Mg-63黏附和遷移數(shù)量下降，與MCP-1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.016，P<0.05)。

1.對(duì)照組；2.模型組；3.治療組。

圖2 AMD3100、SB203580對(duì)Mg-63骨肉瘤細(xì)胞黏附和遷移能力的影響

3 討論

有研究表明，骨肉瘤患者中有30%以上出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，肺轉(zhuǎn)移為其死亡的主要原因之一[7]。探討骨肉瘤的轉(zhuǎn)移以及侵襲的分子機(jī)制對(duì)改善骨肉瘤患者的預(yù)后具有重要價(jià)值和幫助，為治療骨肉瘤尤其是防治其轉(zhuǎn)移提供新的分子靶點(diǎn)，通過相關(guān)機(jī)制的研究為本病的治療提供依據(jù)。LPA受體被稱為細(xì)胞間“多功能磷脂信使”，在多種組織和細(xì)胞中具有廣泛的生物學(xué)功能[8]。LPA受體具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移能力，促細(xì)胞骨架變化[9]。研究發(fā)現(xiàn)LPA受體在人類一些腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，在惡性滲出液中顯著升高，表明LPA受體在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。LPA受體對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展受到多層次多方面影響，其主要通過相關(guān)受體、自身分泌、胞內(nèi)相關(guān)因子等環(huán)節(jié)作用，從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移和黏附以及凋亡和分化能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移。但具體信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控機(jī)制尚不明確。

本研究應(yīng)用LPA受體和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)分子拮抗骨肉瘤細(xì)胞黏附和遷移能力，Transwell結(jié)果顯示第7、14天，Mg-63細(xì)胞與模型組、對(duì)照組相比，體外黏附和遷移能力加強(qiáng)。骨肉瘤細(xì)胞Mg-63治療后第21天，體外黏附和遷移能力與模型組相比減弱。胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)趨化因子SDF-1α、MCP-1在不同時(shí)間段均能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞Mg-63的黏附和遷移，經(jīng)LPA受體干預(yù)及特異性阻斷劑AMD3100、SB203580處理不同時(shí)間段后，黏附和遷移能力下降。

研究發(fā)現(xiàn)LPA受體抑制SaOS-2骨肉瘤細(xì)胞和兔成骨細(xì)胞的凋亡，并且該效應(yīng)能夠被百日咳毒素、Wortmannin以及LY294002所抑制，進(jìn)一步說明LPA受體介導(dǎo)的抗凋亡作用有Gi蛋白和PI-3激酶的參與[11]。這些研究也初步表明骨肉瘤細(xì)胞表面存在LPA受體，并且LPA受體能夠通過受體的介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為如細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。但是LPA受體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞黏附和遷移能力影響的如何，未見相關(guān)報(bào)道[12]?；贚PA受體的某些腫瘤細(xì)胞具有調(diào)控黏附和遷移能力、LPA受體的基本功能研究，我們推斷LPA受體能夠通過其受體調(diào)控，很可能對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具備同樣的生物學(xué)效應(yīng)，影響骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。不同的骨肉瘤細(xì)胞株具有不同的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，因此研究骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尤其是LPA受體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的黏附和遷移能力的影響機(jī)制[14]，并進(jìn)一步探討LPA受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，尋找發(fā)揮關(guān)鍵作用的特異受體或可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子如VASF，然后借助相應(yīng)的受體抑制劑或者小干擾RNA阻斷該信號(hào)傳導(dǎo)通路，以此為抗腫瘤治療靶點(diǎn)，為臨床治療骨肉瘤及骨肉瘤的轉(zhuǎn)移治療提供依據(jù)。

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