李文慧，石大林，賈茹涵，楊靜，張艷艷，陳衛(wèi)，韓躍武

蘭州大學 生物化學與分子生物學實驗室，甘肅 蘭州 730000

世界衛(wèi)生組織 (WHO) 公布，2012年全世界有超過 50萬的宮頸癌新發(fā)病例，其中超過 85%的病例來自發(fā)展中國家。據全國腫瘤登記中心統(tǒng)計，2011年我國宮頸癌新發(fā)病例87 000人，死亡病例23 000人，近30年來宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，且發(fā)病高峰趨于年輕化。宮頸癌早期沒有明顯癥狀和體征，及早發(fā)現宮頸癌前病變，并通過治療阻斷癌前病變的發(fā)展，可最大程度降低宮頸癌的發(fā)生率，因此尋找宮頸癌前病變診斷的生物標志物具有重要意義。1990年 Tuerk等[1]和Ellington等[2]分別報道了應用指數富集配體系統(tǒng)進化技術 (Sysrematie evolution of ligands by exponential enriehmen，SELEX) 篩選得到能與噬菌體 T4 DNA聚合酶和有機染料特異性結合的RNA 片段，并命名為“適配子”或“配體”[3]。該技術原理是利用大容量的隨機單鏈寡核苷酸文庫進行體外多輪篩選、擴增，并最終獲得與非核酸靶分子高親和力、高特異性結合的寡核苷酸序列[4]。大容量的隨機單鏈寡核苷酸文庫進行體外多輪篩選適配體是折疊成特異性3D結構的具有高親和力的單鏈DNA或RNA，能夠特異性結合多肽、蛋白質[5]、細胞[6]乃至整個器官的靶分子[7-9]。另外，適配子在一些生理條件下，可通過反義寡核苷酸雜交使其失活，因此可以用于設計解毒劑[10]。近年來，隨著研究的不斷深入，越來越多實驗結果表明相比于抗體，適配子具有更強的親和力、熱穩(wěn)定性、靶標多樣性、高特異性、可化學合成等優(yōu)點[11-15]，可以代替抗體用于疾病的診斷、醫(yī)藥學和工業(yè)等領域[16]。本研究采用SELEX技術篩選宮頸癌前病變宮頸脫落細胞特異性適配子庫[17-18]，并通過特異性、親和力分析和細胞免疫熒光確立高特異性適配子，可作為宮頸癌前病變診斷標志物，為宮頸癌前病變分子診斷奠定理論基礎，提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

實驗所用樣本均取自液基薄層細胞檢測結果為：正常、炎性、上皮內低級別病變 (CIN1) 上皮內高級別病變 (CIN2、CIN3) 和鱗狀細胞癌宮頸脫落細胞，所有樣本由甘肅迪安同享醫(yī)學檢驗中心提供。

1.1.2 隨機ssDNA文庫及引物

由Prime Premier 5.0軟件設計隨機ssDNA文庫及引物 (表1)[19]，隨機ssDNA文庫5′端和3′端均為18個堿基固定序列，中間N(54)為54個堿基隨機序列。上游引物 P1與 ssDNA文庫 5′端固定序列相同，下游引物P2與ssDNA文庫3′端固定序列互補，同時合成5′端FITC熒光標記的上游引物 P3。上述均由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

表1 隨機ssDNA文庫及引物序列Table 1 Sequences of random ssDNA library and primer

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增反應條件優(yōu)化

經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定隨機ssDNA文庫及引物是否構建成功并確定其條帶位置，同時確定dsDNA條帶的位置，作為后續(xù)實驗PCR產物目的條帶的參考標準。

以 50 μL 反應體系 (模板、引物各 2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL) 進行PCR擴增 (95 ℃變性30 s，退火1 min，72 ℃延伸30 s)，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，ImageJ作灰度分析，確定對稱PCR最佳退火溫度及循環(huán)次數[20-22]、間接不對稱PCR擴增反應最佳循環(huán)數及最佳上下游引物濃度比[23]。

1.2.2 適配子庫篩選

參照文獻采用SELEX技術進行適配子篩選[24]。篩選過程如下：

①細胞預處理：脫落細胞經磷酸鹽緩沖液洗滌數次后用 120目鋼濾過濾，細胞計數板計數，凍存于–80 ℃超低溫冰箱。每次實驗取出細胞凍存管放置37 ℃水浴鍋1 min，離心收集細胞。②ssDNA 文庫預處理：取 ssDNA文庫加入500 μL結合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min。③篩選：向預處理的ssDNA文庫中加入15 μL 3%BSA以降低非特異性吸附，將其與陰性細胞 (正常、炎性) 37 ℃孵育結合，離心取上清，收集與反篩細胞不結合的核酸。再將收集的核酸與陽性細胞 (上皮內低級別病變 (CIN1)、上皮內高級別病變 (CIN2、CIN3) 和鱗狀細胞癌) 37 ℃孵育結合，離心取沉淀，加入洗滌緩沖液洗滌以棄去未與細胞結合的核酸，再加入200 μL洗脫緩沖液，離心取上清，收集得到與正篩細胞結合的核酸。④次級文庫獲得：收集到的核酸經苯酚∶氯仿∶異戊醇法純化后，經間接不對稱PCR擴增、回收單鏈作為下一輪篩選的次級文庫。⑤測定結合率：以每輪篩選獲得的次級文庫為模板進行間接不對稱PCR擴增，擴增得到熒光素標記的ssDNA。取200 pmol熒光修飾的ssDNA和1 000 μL結合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分別與2×106個/mL陰性細胞、陽性細胞37 ℃孵育結合30 min，熒光分光光度計測定總熒光強度；回收細胞懸液離心后用洗滌緩沖液洗滌3次，重懸于1 000 μL結合緩沖液中，熒光分光光度計測定熒光強度值，測3次取平均值；不加熒光修飾的ssDNA為空白對照。根據ssDNA文庫與細胞結合率=熒光強度平均值/總熒光值×100%，分別計算各輪篩選獲得的次級文庫與陽性細胞及陰性細胞的結合率判斷篩選進度。⑥整個篩選過程通過不斷增加篩選壓力，如減少加入的ssDNA量、減少孵育時間、增加洗滌次數，以獲得高親和力、高特異性適配子庫。經過10–12輪篩選，次級文庫與靶細胞結合強度不再增加，達到平臺期則篩選終止。篩選條件見表2。⑦將最終獲得的 ssDNA核酸適配子庫送生工生物工程 (上海) 股份有限公司克隆測序，運用DNAMAN軟件進行一級結構同源性分析。

1.2.3 高特異性適配子確立

測序后，選擇長度正確且沒有雙峰的適配子，將其轉化菌經培養(yǎng)、質粒抽提，制備熒光素標記的ssDNA。

1) 特異性測定：取200 pmol熒光素標記的適配子加入1 000 μL結合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分別與2×106個/mL陰性細胞、陽性細胞37 ℃孵育結合30 min，離心去上清，洗滌緩沖液洗滌 3次，重懸于 1 000 μL結合緩沖液中，測定熒光強度值，測3次取平均值。

2) 親和力分析：制備不同濃度熒光素標記的適配子，取等體積適配子加入1 000 μL結合緩沖液，沸水浴 5 min，冰浴 10 min；分別與 2×106個/mL陽性細胞37 ℃孵育結合30 min，離心去上清，洗滌緩沖液洗滌3次，重懸于1 000 μL結合緩沖液中，測定熒光強度值，測3次取平均值。根據公式Y=Bmax×X/ (Kd+X)，運用 SigmaPlot 12.1軟件，在非線性分析Regression Wizard公式類型中選擇雙曲線 (Hyperbola) 的類型，對數據進行分析，結合SPSS 16.0軟件得出各適配子與宮頸癌前病變宮頸脫落細胞的平衡解離常數Kd值。

3) 細胞免疫熒光：根據特異性及親和力分析結果確立高特異性適配子，進一步明確該適配子能夠與子宮頸癌前病變宮頸脫落細胞特異性結合。分別取 1×106個/mL陰性細胞、陽性細胞爬片后經4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；抗原修復液沸水浴10 min，0.01 mol/L PBS洗滌 3次，每次 5 min；1%Triton-X100通透10 min，傾去后加入10%正常山羊血清37 ℃恒溫封閉30 min；傾去封閉液后加入熒光素標記的適配子 (由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成)，4 ℃避光過夜；0.01 mol/L PBS洗滌 3次，每次 5 min；抗熒光衰減封片劑 (含DAPI) 封片后觀察。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增反應條件優(yōu)化結果

以文庫為模板，經對稱PCR后得到90 bp的dsDNA目的條帶，即 ssDNA文庫及引物構建成功。根據2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (圖1)，確定對稱PCR擴增反應最佳循環(huán)數為15個循環(huán)；最佳退火溫度為49.5 ℃；間接不對稱PCR擴增反應最佳循環(huán)數為35個循環(huán)；最佳上下游引物濃度比為80∶1。

圖1 PCR條件優(yōu)化Fig. 1 Optimization of PCR conditions. (A) The verification result of random ssDNA library, primer and ssDNA PCR products. 1: random ssDNA library; 2?3: primer; 4: ssDNA PCR products. (B) Optimization of symmetry PCR conditions. A?H annealing temperature: 55, 54.5, 53.5, 51.7, 49.5, 47.8, 46.6, 46 ℃; 1?7 cycle times: 5, 8, 10, 12, 15,20, 25. (C) Optimization of indirect asymm PCR conditions. A?D cycle times: 30, 35, 40, 45; 1?5 primer concentration ratio: 10:1, 30:1, 50:1, 80:1, 100:1.

2.2 宮頸上皮內癌變宮頸脫落細胞SELEX篩選

2.2.1 篩選條件

篩選過程中，一方面加入BSA以封閉非特異性結合位點，去除非特異性結合從而提高篩選效率；另一方面，剛開始進行篩選時，如果ssDNA文庫加入量過少會導致篩選失敗，因此要以較多量的ssDNA和細胞進行前幾輪篩選，隨著篩選的進行要不斷增加篩選壓力 (表 2)，使特異性的ssDNA能競爭結合在細胞膜表面的特異性物質上而特異性較弱的ssDNA被淘汰。

2.2.2 次級文庫鑒定

每輪篩選獲得的次級文庫經不對稱PCR擴增ssDNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (圖2)，可見90 nt目的片段ssDNA，滿足篩選要求，可作為下輪篩選的文庫。

2.2.3 結合率測定

在12輪篩選過程中，次級文庫與陽性細胞的結合率從17%增加至75%；與陰性細胞的結合率從83%減少至19% (圖3)。隨著篩選的進行，在第9輪后結合率基本穩(wěn)定達到平臺期，說明特異性高的適配子得到富集，即篩選結束。

2.2.4 核酸適配子庫克隆測序及一結構同源性分析

隨機挑選40個克隆子進行測序，結果發(fā)現大量重序列及2個錯誤序列，最終確定適配子庫共有9條適配子序列 (表3)。DNAMAN 7.0軟件進行一級結構同源性分析表明 (圖 4) 所有序列無共同的保守序列，但CIN-Ap2、CIN-Ap3、CIN-Ap4和CIN-Ap9含有保守序列GGGAT，剩下的適配子無同源性，且無共有保守序列。

2.3 高特異性適配子確立

2.3.1 適配子特異性及親和力分析

9條適配子 (除CIN-Ap1) 與陽性細胞和陰性細胞結合力均具有極顯著性差異 (P<0.01)，其中適配子CIN-Ap3、CIN-Ap4、CIN-Ap5、CIN-Ap6的特異性較高。擬合各適配子與陽性細胞的結合曲線，計算得到平衡解離常數Kd值。根據解離常數Kd值越小，親和力越大，確定CIN-Ap4、CIN-Ap5具有較高的親和力 (圖 5)。綜合上述結果，最終確立 CIN-Ap4作為子宮頸癌前病變宮頸脫落細胞高特異性適配子。

表2 適配子各輪篩選條件Table 2 Screening conditions of aptamer

2.3.2 適配子CIN-Ap4細胞免疫熒光

采用細胞免疫熒光法進一步驗證適配子CIN-Ap4與陽性細胞和陰性細胞結合力 (圖6)，陽性細胞組熒光強度遠高于陰性細胞組，說明所確立的適配子CIN-Ap4確實能夠與子宮頸癌前病變宮頸脫落細胞高特異性結合，可作為子宮頸癌前病變診斷標志物，為宮頸癌前病變宮頸分子診斷提供理論基礎和新思路。

圖2 1–12輪篩選獲得的ssDNA次級文庫產物電泳圖Fig. 2 2% agarose gel electrophoresis of ssDNA secondary library. M: marker; 1–12: ssDNA secondary library for each round.

圖3 1–12輪ssDNA次級文庫與宮頸脫落細胞熒光結合率Fig. 3 The combination rate of ssDNA secondary library and cervical exfoliation cells for 12 rounds.

表3 適配子序列Table 3 Sequences of aptamers

圖4 適配子同源性比對結果Fig. 4 Homology comparison.

圖5 適配子特異性及親和力分析結果Fig. 5 Specificity and affinity analysis of aptamers. (A) Specific analysis. (B) Affinity analysis.

圖6 適配子CIN-Ap4細胞免疫熒光結果Fig. 6 Cell immunofluorescence of CIN-Ap4.

3 討論

對稱PCR和不對稱PCR是實驗過程的關鍵，對 PCR反應條件進行優(yōu)化，尤其對不對稱 PCR條件進行優(yōu)化，是獲得特異性和親和力均較強的ssDNA適配子的核心。適配子的篩選過程就是不斷重復PCR的過程，所以PCR是篩選適配子的關鍵。優(yōu)化PCR條件可以降低非特異性擴增，得到高特異性、高純度的PCR產物，為今后篩選目標物的適配子奠定一定的基礎。但值得一提的是，我們發(fā)現在開始的幾輪篩選過程中，對稱PCR及不對稱PCR均能獲得較高特異的目的產物。但在后面的幾輪篩選過程中，即使在優(yōu)化的條件下，PCR非特異性產物增多。分析原因可能是篩選之初模板純度高，所以PCR產物特異性高，但經過多輪篩選后模板純度降低，故PCR產物特異性降低，尤其是不對稱PCR要經過35個如此多的循環(huán)，非特異性產物會更多[25-26]，因此在篩選過程中可采用多次膠回收的方法以提高每一輪ssDNA純度。

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