薛金才，劉勤江，田尤新，侯小峰

甘肅省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，甘肅 蘭州 730050

近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率迅速上升，其中甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）占很大比例（31%～54%）［1］。PTMC是指直徑≤1.0 cm的甲狀腺乳頭狀癌，是1988年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在甲狀腺癌的組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)中取代了原來(lái)隱性癌的概念而規(guī)定的［2］。大多數(shù)PTMC預(yù)后良好，但有少部分PTMC可能預(yù)后不良。若能發(fā)現(xiàn)分子診斷標(biāo)志物精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)其預(yù)后情況，就能更好地指導(dǎo)臨床制定診療方案。本研究分析BRAFV600E與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）啟動(dòng)子突變情況及與PTMC危險(xiǎn)因素的相關(guān)性，期望為臨床PTMC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及方法

回顧性分析甘肅省腫瘤醫(yī)院頭頸外科2014年10月—2016年6月首診治療的107例PTMC患者，其中男性24例，女性83例。年齡14～76歲，平均年齡（44.0±11.8）歲，＜45歲48例，≥45歲59例。腫瘤大小≤5 mm 38例，＞5 mm 69例。多灶腫瘤28例，單發(fā)79例。侵犯包膜41例，未侵犯包膜66例。不良病理亞型（高細(xì)胞亞型、柱狀細(xì)胞亞型及嗜酸細(xì)胞亞型等）19例，無(wú)不良病理亞型88例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期64例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移pN1期（N1a期+N1b期）43例（表1）。所有研究對(duì)象均無(wú)既往腫瘤病史，進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范手術(shù)治療并病理確診。本研究經(jīng)過甘肅省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)備案，入組前本著自愿原則，與研究對(duì)象及家屬簽署知情同意書。

1.2 測(cè)序方法

采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）直接測(cè)序法檢測(cè)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變的情況，TERT啟動(dòng)子包括C228T及C250T位點(diǎn)。用4%甲醛溶液固定腫瘤組織，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行5～10 μm厚度切片。取1張切片進(jìn)行常規(guī)H-E染色后由病理醫(yī)師鑒定并評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量，另取2～4張切片提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量后，將質(zhì)量較高的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果分別與BRAF和TERT基因序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是否發(fā)生突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各變量的單因素分析采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用二元logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTMC的BRAFV600E突變分析

P T M C的B R A FV600E突變率為6 8.2%（73/107）。性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)病灶數(shù)目及有無(wú)不良病理亞型的變化與BRAFV600E突變均無(wú)顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。有無(wú)被膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E突變均有顯著相關(guān)性（P 均＜0.01）。多因素Logistic分析顯示，與BRAFV600E突變顯著相關(guān)的因素包括甲狀腺被膜侵犯（P=0.012）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.000，表1、2）。

2.2 PTMC的TERT啟動(dòng)子突變分析

PTMC的TERT啟動(dòng)子突變率為11.2%（12/107），其中TERT C228T位點(diǎn)突變率為66.7%（8/12）、TERT C250T位點(diǎn)突變率為33.3%（4/12）。年齡、性別、有無(wú)被膜侵犯、有無(wú)不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TERT啟動(dòng)子突變均有顯著相關(guān)性（P均＜0.05）。腫瘤大小及原發(fā)病灶數(shù)目與TERT啟動(dòng)子突變均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。多因素Logistic分析顯示，男性（P=0.004）、年齡＜45歲（P=0.026）、甲狀腺被膜侵犯（P=0.004）、不良病理亞型（P=0.030）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.043）與TERT啟動(dòng)子突變均有顯著相關(guān)性（表1、2）。

2.3 甲狀腺微小乳頭狀癌BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變分析

甲狀腺微小乳頭狀癌TERT啟動(dòng)子突變12例，其中9例（75%）同時(shí)伴有BRAFV600E突變。年齡、性別、有無(wú)被膜侵犯、有無(wú)不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變均有顯著相關(guān)性（P均＜0.05）。腫瘤大小及原發(fā)病灶數(shù)目與BRAFV600E和TERT同時(shí)突變均無(wú)顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。多因素Logistic分析顯示，男性（P=0.022）、甲狀腺被膜侵犯（P=0.023）、不良病理亞型（P=0.041）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.030）與BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變均有顯著相關(guān)性（表1、2）。

表1 PTMC的BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變與臨床病理特征的相關(guān)性Tab1 Relationship of BRAFV600E and TERT promoter mutations with clinicopathological features of PTMC

3 討 論

PTMC是甲狀腺乳頭狀癌最常見的特殊類型，大多數(shù)PTMC處于低危狀態(tài)，預(yù)后良好。Yu等［3］在1項(xiàng)納入18 445例PTMC的Meta分析中指出，PTMC的15年生存率約90.7%。但是部分PTMC具有高侵襲性的臨床病理特點(diǎn)［4-6］，可出現(xiàn)原發(fā)灶很小而有頸部轉(zhuǎn)移，甚至全身多發(fā)轉(zhuǎn)移。有研究顯示，PTMC與甲狀腺乳頭狀癌的臨床特征和生物學(xué)行為相似，治療方案應(yīng)一致［7-8］。多年來(lái)對(duì)于PTMC的治療一直存在爭(zhēng)議［9］，甚至出現(xiàn)了“過猶不及”的聲音。如何在眾多PTMC患者中篩查出高危人群，做到有的放矢的治療呢？這需要借助于分子病因?qū)W及分子影像學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展［10-12］。

目前對(duì)于PTMC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵指標(biāo)包括腫瘤直徑、多灶性、被膜受侵、不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等［13］，大多以回顧性研究及術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果為主，對(duì)術(shù)前評(píng)估及術(shù)中指導(dǎo)價(jià)值有限。臨床迫切需要發(fā)現(xiàn)更多分子標(biāo)志物用于診斷、預(yù)后評(píng)估尋找新的治療靶點(diǎn)。篩選出對(duì)PTMC治療有價(jià)值的分子生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于制定合理規(guī)范的診療方案顯得尤為重要。BRAF、TERT及TP53等基因突變的檢測(cè)有助于解決PTMC的風(fēng)險(xiǎn)分層、預(yù)后預(yù)測(cè)及治療靶點(diǎn)等問題［14］。

BRAF基因是由Ikawa等［15］在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列，BRAF基因T1799A位點(diǎn)突變可引起MAPK通路激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和癌變，與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16］。BRAFV600E是甲狀腺癌較常見的突變基因之一，診斷特異度高達(dá)100%，靈敏度性達(dá)到85.1%［17］。但隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)靈敏度的提高，BRAFV600E基因突變?cè)诩谞钕侔┲械臋z出率越來(lái)越高，BRAF基因突變作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)存在爭(zhēng)議［18］。

多項(xiàng)研究顯示，BRAF基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)，可以用于評(píng)估甲狀腺乳頭狀癌的危險(xiǎn)程度［19-20］。Xing等［21］的研究顯示，BRAF基因突變對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的復(fù)發(fā)有預(yù)后價(jià)值。一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，2 470例甲狀腺乳頭狀癌患者中，BRAFV600E突變型比BRAF野生型具有更高的復(fù)發(fā)率（24.9%vs 12.6%），BRAFV600E突變與腫瘤侵襲性特征呈正相關(guān)［22］。Zheng等［23］對(duì)997例PTMC患者的研究發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高（50.8% vs 5.1%，P＜0.05），是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.96，P=0.03）。Lin等［24］的研究顯示，BRAF基因突變的PTMC患者側(cè)方淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高（65% vs 23%，P=0.002）。

有些學(xué)者持反對(duì)意見，Czarniecka等［25］的研究顯示，腫瘤復(fù)發(fā)主要與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺包膜受侵有關(guān)，與BRAFV600E突變無(wú)關(guān)。BRAF狀態(tài)與復(fù)發(fā)及無(wú)病生存率無(wú)關(guān)(P=0.76)。還有研究顯示，BRAF基因突變并沒有增加PTMC的侵襲性［26］。Takacsova等［27］通過一項(xiàng)199例樣本量的單中心回顧性研究，評(píng)估BRAFV600E突變對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌復(fù)發(fā)的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果表明，年齡＜35歲及≥60歲的高危組BRAFV600E突變者比低危組BRAFV600E未突變者，局部殘留和復(fù)發(fā)率分別增加17.28和33.49倍。Wang等［28］報(bào)道了國(guó)內(nèi)最早關(guān)于BRAF基因突變的研究，其結(jié)果表明，BRAF突變與甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后無(wú)相關(guān)性，僅與患者的年齡相關(guān)。由此可見，BRAF基因突變預(yù)后價(jià)值較為復(fù)雜，應(yīng)與其他分子相關(guān)聯(lián)或與其他臨床病理因素聯(lián)合用于腫瘤的預(yù)后分析。

本研究結(jié)果顯示，PTMC的BRAFV600E突變率為68.2%（73/107）。性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)病灶數(shù)目及有無(wú)不良病理亞型與BRAFV600E突變均無(wú)顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。有無(wú)被膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E突變均有顯著相關(guān)性（P均＜0.01）。多因素logistic分析顯示，PTMC與BRAFV600E突變顯著相關(guān)的因素包括甲狀腺被膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2013年Liu等［29］首次在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變。De Biase等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，431例PTMC患者的TERT啟動(dòng)子突變率為4.7%。Qasem等［31］認(rèn)為TERT啟動(dòng)子突變與腫瘤大小有關(guān)，而在另一項(xiàng)研究中，TERT啟動(dòng)子突變與腫瘤大小無(wú)關(guān)［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，PTMC的TERT啟動(dòng)子突變率為11.2%（12/107），年齡、性別、有無(wú)被膜侵犯、有無(wú)不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TERT啟動(dòng)子突變均有顯著相關(guān)性（P均＜0.05）。腫瘤大小及原發(fā)病灶數(shù)目與TERT啟動(dòng)子突變均無(wú)顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。多因素logistic分析顯示，男性、年齡＜45歲、甲狀腺被膜侵犯、不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TERT啟動(dòng)子突變均有顯著相關(guān)性。

有研究顯示，BRAFV600E與TERT啟動(dòng)子突變的發(fā)生呈正相關(guān)［33］，唐新月等［34］的研究顯示，BRAFV600E與TERT啟動(dòng)子聯(lián)合突變具有一定協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PTMC的BRAFV600E突變與性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)病灶數(shù)目及有無(wú)不良病理亞型均無(wú)顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。但是合并TERT突變后，這些臨床病理參數(shù)發(fā)生變化，出現(xiàn)顯著相關(guān)性（P＜0.05），多因素logistic分析顯示，男性、甲狀腺被膜侵犯、不良病理亞型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E和TERT同時(shí)突變均有顯著相關(guān)性，而這些參數(shù)是PTMC復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，提示聯(lián)合檢測(cè)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變對(duì)PTMC分險(xiǎn)評(píng)估有重要價(jià)值。

PTMC預(yù)后好，治療爭(zhēng)議多，相關(guān)分子生物學(xué)研究目前尚無(wú)定論。關(guān)于BRAFV600E突變的研究已經(jīng)多有報(bào)道，然而有關(guān)BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變的研究，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，國(guó)外主要集中于臨床分期晚或預(yù)后差的腫瘤中，針對(duì)PTMC的研究仍較少見。本研究結(jié)果顯示，同時(shí)出現(xiàn)BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變可能與PTMC的不良預(yù)后相關(guān)，但機(jī)制尚不明確。聯(lián)合檢測(cè)BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變對(duì)PTMC的預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值，可能成為PTMC不良預(yù)后的分子診斷指標(biāo)。

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