章銀珠 ，楊廣，李冬梅，勵丹，翁婉丹

(寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江 寧波 315000)

釀造醬油醬香味濃郁、味道鮮美、色澤誘人，是生活中必不可少的調(diào)味品。醬油獨特的美味主要是鮮味，Hanifah Nuryani Lioe等指出，醬油的鮮味主要是一些分子量小于500 Da的物質(zhì)，而游離氨基酸是在鈉鹽存在下對味覺有重要作用的低分子化合物。另外還有一些肽類物質(zhì)，盡管其含量極低，但對鮮味卻有很大的貢獻作用[1,2]?？梢姡u油氨基酸態(tài)氮的含量對醬油的營養(yǎng)和質(zhì)量有著至關重要的影響。通常，氨基酸態(tài)氮含量越高，醬油品質(zhì)就越高，鮮味也會越濃。而醬油的國家標準也是根據(jù)氨基酸態(tài)氮的含量來分級，特級醬油的氨基酸態(tài)氮需要大于0.80 g/dL，而最低等級三級的醬油，其氨基酸態(tài)氮含量也要不低于0.40 g/dL。因工藝的改進，市售的特級醬油氨基酸態(tài)氮含量可以達到1.20 g/dL以上。

傳統(tǒng)的氨基酸測定的方法原理是依據(jù)其氨基酸兩性分子結構，即呈堿性的氨基端或者呈酸性的羧基端。醬油的國家標準GB 18186-2000《醬油》規(guī)定，氨基酸態(tài)氮含量的檢測方法為甲醛值法[3]。該法的原理為定量羧基，即加入甲醛以固定氨基端的堿性，使羧基端顯示出酸性，再用氫氧化鈉標準滴定溶液定量。該法分析成本較低，測定結果也準確，因此被廣泛應用。但是它的缺點是滴定速度較慢，檢測過程中儀器設備和試劑等的影響因素也較多。新實行的食品安全國家標準GB 5009.235-2016規(guī)定醬油氨基酸態(tài)氮的檢測方法分別為酸度計法(甲醛值法)和比色法[4]。比色法的原理為定量氨基端，用硫酸銨為標準物質(zhì)，用分光光度法顯色定量。該法操作簡便、靈敏、快速、取樣量少，適合批量處理，但是該法目前應用不普遍，尤其在企業(yè)中甚少使用。本文探討了比色法應用過程中的注意事項，同時對市售的多種不同等級的醬油的氨基酸態(tài)氮含量進行多次測定，結果與酸度計法結果相一致[5-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

紫外可見分光光度計：普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試劑

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.8)、甲醛溶液(36%～38%)、顯色劑： 37%甲醛15 mL與乙酰丙酮7.8 mL混合，加水稀釋定容至100 mL，劇烈振搖混勻；氨氮標準儲備液(1.0 mg/mL)：稱取0.4720 g 在105 ℃干燥2 h的硫酸銨，加水稀釋至100 mL，混勻；氨氮標準使用液(0.1 mg/mL)：移取10 mL氨氮標準儲備液于100 mL容量瓶中，用水稀釋定容，混勻。所有試劑均為國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作

分別移取氨氮標準使用溶液(0.1 mg/mL)0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL比色管中，分別加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4 mL、顯色劑4 mL，用水稀釋至刻度，混勻。然后置沸水浴中加熱15 min后取出，冷卻至室溫。最后以零管為參比調(diào)零，用10 mm比色皿，于400 nm波長處測量標準曲線溶液的吸光值。以吸光度為縱坐標，氨氮含量為橫坐標，繪制標準的曲線，并計算線性回歸方程[9，10]。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定

稱取試樣1.00 g(m)于100 mL(V2)容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。吸取該稀釋液0.50 mL(V1)于10 mL比色管中，加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4 mL及顯色劑4 mL，用水稀釋至刻度，混勻。然后置沸水浴中加熱15 min后取出，冷卻至室溫。而后以零管為參比，用10 mm比色皿，于400 nm波長處測量試樣溶液的吸光值。同時進行樣品空白試驗。試樣吸光度扣除樣品空白吸光度后，代入線性回歸方程，計算試樣中氨基酸態(tài)氮的含量(m1)。

氨基酸態(tài)氮含量(g/100 g)=m1m×1000×1000×V1V2×100。

2 結果

2.1 顯色劑的放置時間的影響

分別用現(xiàn)配、放置1天、放置2天、放置3天、放置4天、放置5天的顯色劑對標準曲線溶液及同一個樣品進行顯色，記錄其吸光值，并根據(jù)所繪制標準曲線來測定該樣品中氨基酸態(tài)氮的含量并測定其加標回收率，測定結果見表1。

表1 放置不同時間的顯色劑對標準曲線單點的測定結果Table 1 Results of the single point of the standard curvedetermined by the color reagent of different time

由表1可知，隨著顯色劑放置時間的延長，標準曲線線性明顯下降(從0.0113降到0.0082)，測定結果也偏低，導致回收率偏高。而放置3天以后的回收率已經(jīng)不符合實驗室要求。

2.2 樣品空白的影響

醬油本身具有較深的醬色，市售的醬油通常分為生抽和老抽，生抽主要用來上淺色或者佐餐，而老抽顏色較深且濃稠，主要用來上色。本試驗分別抽取生抽和老抽各3種進行樣品空白處理：吸取試樣稀釋液0.5 mL，加入緩沖溶液4 mL，不加顯色劑，直接用水稀釋定容至10 mL，于400 nm處測定吸光值，樣品空白吸光值見表2。

表2 樣品空白吸光度Table 2 Sample blank absorbance

由表2可知，不同種醬油空白值不同，生抽較小，可忽略，而老抽的吸光值較大，測定中必須扣除樣品空白。

2.3 冷卻方式的影響

試驗過程中，加顯色劑后需在沸水浴中顯色，若令其自然冷卻，結果會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，將其過膜后比色試驗吸光值偏低(見表3)，在樣品中表現(xiàn)尤為明顯，最大的吸光值差為0.132。而沸水浴15 min后若迅速將其冷卻，則未出現(xiàn)渾濁，冷卻后色澤恒定，且未再次出現(xiàn)渾濁。究其原因是自然冷卻使其加熱時間相對延長，因此沸水浴后需迅速冷卻。

表3 冷卻方式對吸光度的影響Table 3 Influence of cooling methods on absorbance

2.4 標準曲線的繪制

繪制的標準曲線及回歸方程，結果見表4。

表4 標準曲線Table 4 Standard curve

2.5 回收率試驗

對比色法進行回收率試驗，結果見表5。

表5 回收率試驗Table 5 Recovery test

2.6 比色法測定醬油氨基酸態(tài)氮

對市售的5種醬油的氨基酸態(tài)氮含量進行測定，并進行平行試驗，結果見表6[11]。試驗數(shù)據(jù)精密度較好，絕對標準偏差符合要求(<10%)。

表6 比色法測定醬油氨基酸態(tài)氮的結果Table 6 Determination of amino acid nitrogen in soy sauce by colorimetry

注：線性回歸方程為y=0.0113x，R2=0.9993。

2.7 比色法與酸度計法測定結果比較

另取10個品種的醬油樣品，分別用酸度計法和比色法測定其氨基酸態(tài)氮的含量，結果見表7?？梢?，2種方法無顯著性差異(P>0.05)。

表7 兩種方法測定氨基酸態(tài)氮的結果比較Table 7 Comparison of results of two methods for the determination of amino acid nitrogen

3 討論

顯色劑為顯色反應關鍵試劑。配制顯色劑時，甲醛溶液不應有沉淀且溶液不分層，與乙酰丙酮混合時必須劇烈振搖，充分混勻。該混合試劑不能放在冰箱內(nèi)保存，應在室溫下放置。因甲醛放置時間過長會形成聚合沉淀析出晶體造成失效，在較冷時久貯易渾濁，在低溫時則形成三聚甲醛沉淀；而乙酰丙酮受光作用會轉化成褐色液體，并且生成樹脂。而表1也表明，放置時間越長，顯色效果下降，放置3天后下降較前3天明顯，且與滴定法相比，樣品測定結果偏低，回收率也變差，且放置3天后的回收率已不能滿足實驗室的檢測要求(要求95%～105%)，故顯色劑需存放于棕色試劑瓶中，且不宜放置過長時間使用，室溫下放置3日內(nèi)使用。

醬油有較深的醬色，且不同的醬油色澤深淺不一，醬油稀釋液本身帶黃色本底，而400 nm處為黃色吸收波段，本底對顯色結果有影響。通過考察不同的老抽和生抽醬油的樣品空白值(見表2)不同醬油的樣品空白值差異較大，生抽的本底相對較小，而老抽因其色澤太深，且相對粘稠，空白吸光值較大，因此，需進行樣品空白試驗。

沸水浴顯色后需迅速冷卻以防止溶液出現(xiàn)渾濁。

4 結論

綜上分析，用比色法測定醬油中氨基酸態(tài)氮含量時，需注意顯色劑的使用、扣除樣品顏色本底、沸水浴后迅速冷卻比色。與酸度計法比較，兩種方法結果無顯著性差異(P>0.05)，因此兩種方法雖然測定原理不同，但只要保證方法數(shù)據(jù)準確，兩種方法的結果是一致的，可以根據(jù)實驗儀器設備條件和樣品批量自由選擇方法。

參考文獻：

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