張媛媛，李濤

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266000)

從化學(xué)的角度來(lái)看，香料分子由許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)組成，這些化學(xué)特性賦予它們各種不同的氣味；除了食品和飲料，香料工業(yè)還囊括香水、清潔產(chǎn)品、肥皂、洗滌劑和口腔保健產(chǎn)品等。

自然界中，氣味通常是動(dòng)物種間或種內(nèi)交流的一種形式，動(dòng)物通過(guò)氣味來(lái)吸引共生伙伴，震懾捕食者。有些氣味分子是機(jī)體代謝物，可用作天然殺蟲劑、信息素或天然產(chǎn)物的前體。除了供人類消費(fèi)，一些合成的香料化合物還可作為高能燃料、溶劑以及藥物前體。

從發(fā)展歷史來(lái)說(shuō)，植物提取是香料化合物最初的、主要的來(lái)源，人們深入分析植物殘?jiān)b別出單一組分，推動(dòng)了人工合成法的發(fā)展；此后生物技術(shù)的發(fā)展則為香料生產(chǎn)開辟了又一可行的合成途徑，并在香料高效、靈活、低能耗的生產(chǎn)要求下應(yīng)運(yùn)而生。理論上，每一種天然香味分子都對(duì)應(yīng)一種生物合成方法，通過(guò)確定合適的生物合成路徑和宿主，控制其代謝通量，優(yōu)化基因背景并調(diào)控基因的表達(dá)，我們就能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)化合物的高效生產(chǎn)。本文對(duì)利用各種微生物、底物及生化途徑生產(chǎn)典型香料化合物的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 乙偶姻

乙偶姻是具有黃油風(fēng)味的天然物質(zhì)，它是細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的中間體。此前已有乙偶姻生物法生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道,如通過(guò)山梨糖菌、生膜菌作用于2,3-丁二醇獲得或者通過(guò)青霉菌等真菌作用于甘蔗汁獲得[1],但這些方法均不適合工業(yè)化生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，乙偶姻的生物合成始于兩分子丙酮酸縮聚生成乙酰乳酸，該過(guò)程由乙酰乳酸合成酶催化；之后乙酰乳酸脫羧酶催化乙酰乳酸脫羧生成乙偶姻。自然界中有許多微生物能夠合成乙偶姻，研究較多的主要包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及氣單胞菌屬(Aeromonas)等[2]。如：在相應(yīng)的兩種酶存在的情況下，大腸桿菌能作用于葡萄糖生成乙偶姻。使用這一方法能夠得到滴定度高達(dá)870 mg/L 的乙偶姻，見表1[3]。

乙偶姻生物合成也可使用天然酵母。首先丙酮酸脫羧酶將丙酮酸活化進(jìn)而形成乙醛-噻胺二磷酸酯復(fù)合物，之后該復(fù)合物再與另一分子乙醛縮合生成乙偶姻。為了優(yōu)化乙偶姻的代謝通量，需將基因組中編碼乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的基因敲除；另外，為避免乙偶姻還原為2,3-丁二醇，編碼2,3-丁二醇脫氫酶的基因也要敲除掉。這一方法使得乙偶姻的生產(chǎn)達(dá)到7.3 g/L，相應(yīng)產(chǎn)量為0.07 g/g ，生產(chǎn)率為0.11 g/L/h ，見表1[4]。

相似的是使用枯草芽孢桿菌來(lái)生產(chǎn)乙偶姻，趙祥穎等[5]選育獲得了一株高產(chǎn)枯草芽孢桿菌，稱可有效轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻，且不產(chǎn)生副產(chǎn)物丁二酮和2,3-丁二醇。在自然條件下枯草芽孢桿菌通過(guò)前述乙酰乳酸/乙偶姻代謝途徑產(chǎn)出2,3-丁二醇；在移除2,3-丁二醇脫氫酶、提供NADH氧化酶的情況下能使乙偶姻產(chǎn)量提高35.3%而達(dá)到56.7 g/L，見表1[6]。

表1 微生物生產(chǎn)各種風(fēng)味和香料化合物的滴度、產(chǎn)率和產(chǎn)量Table 1 Titer, productivity and yield for microbial productionof various flavors and flavoring compounds

注：T.M.為理論最大值；N.A.為無(wú)；glc為葡萄糖；ba為苯甲醛；gly為甘油。

2 甲基酮類

甲基酮具有精油和奶制品的香味，脂肪酸的β-氧化可產(chǎn)生不同長(zhǎng)度碳鏈的甲基酮類化合物。大腸桿菌自有的β-氧化途徑始于脂肪酸轉(zhuǎn)化為酰基輔酶A，該過(guò)程由?；o酶A合成酶Fad D催化；之后，在酰基輔酶A脫氫酶Fad E的催化下，酰基輔酶A被氧化生成反-2-烯酰輔酶A；Fad B隨后β-羥基化、氧化該物質(zhì)，生成β-酮酰輔酶A；再經(jīng)Fad A催化硫解斷鍵，得到一分子乙酰輔酶A和一分子脂肪族酰基輔酶A。

生產(chǎn)中為了提高β-酮酰輔酶A的通量，需調(diào)控使大腸桿菌DH1中編碼異源?；o酶A氧化酶的基因和自有的編碼Fad B的基因，使其過(guò)表達(dá)，并從基因組中敲除編碼Fad A的基因；另外，F(xiàn)ad M也被過(guò)量表達(dá)，最終使甲基酮產(chǎn)量提高了700倍[7]。優(yōu)化脂肪酸基因的表達(dá)能大幅提高甲基酮的產(chǎn)量，使其在發(fā)酵45 h后達(dá)到3.4 g/L，見表1[8]。

3 醛類和醇類

異丁醛是帶有支鏈的醛，具有葡萄酒和啤酒發(fā)酵過(guò)程中的麥芽香味，以前用于異丁醇生產(chǎn)的大腸桿菌代謝途徑可被截?cái)鄟?lái)生產(chǎn)異丁醛，在異丁醇制備途徑中，2-酮異戊酸(產(chǎn)自L-纈氨酸生物合成過(guò)程)首先脫羧形成異丁醛，然后異丁醛被還原生成異丁醇。使用大腸桿菌JCL260菌株生產(chǎn)異丁醛需缺失大量天然異丁醛還原酶基因以使其產(chǎn)量達(dá)到1.5 g/L/OD600[9]；原位產(chǎn)物移除結(jié)合相關(guān)基因缺失使得異丁醛產(chǎn)量最終達(dá)35 g/L(理論產(chǎn)量的45%)，見表1。

醛還原酶基因的缺失還有助于香草醛和苯甲醛的生物合成。

大腸桿菌中存在高通量的內(nèi)源性莽草酸合成途徑，蘇云金芽孢桿菌則能通過(guò)莽草酸途徑將細(xì)胞代謝物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物；香草醛則隨后由O-甲基轉(zhuǎn)移酶(智人)和羧酸還原酶(car，諾卡氏菌)催化而來(lái)。通過(guò)整合這些代謝途徑，敲除大腸桿菌中醛還原酶編碼基因能夠使香草醛產(chǎn)量達(dá)到119 mg/L(底物為葡萄糖，1.2%，W/V )，見表1[10]。

類似地，在大腸桿菌培養(yǎng)液中提供重組羧酸還原酶可以將苯甲酸鹽轉(zhuǎn)化為苯甲醛。甲基營(yíng)養(yǎng)巴斯德畢赤酵母亦能實(shí)現(xiàn)由芐醇生成苯甲醛的生物氧化過(guò)程。在一個(gè)3 L的培養(yǎng)體系中，反應(yīng)系統(tǒng)能夠?qū)?0.7 g 芐醇轉(zhuǎn)化成14.4 g 苯甲醛，生產(chǎn)率為97 mg/L/h ，見表1[11]。而且相比于苯甲酸鹽途徑，芐醇代謝途徑效價(jià)更高并可作用于經(jīng)濟(jì)底物(如甲醇和甘油)。

4 萜類

萜類化合物在自然界中十分豐富，以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元，廣泛應(yīng)用于制藥和化妝品行業(yè)。從植物中提取萜缺乏經(jīng)濟(jì)性，大規(guī)模的微生物生產(chǎn)途徑才能滿足萜類化合物巨大的市場(chǎng)需求。

月桂烯是一種單萜，常用作香葉醇、薄荷醇這類復(fù)雜化合物的骨架。通過(guò)甲羥戊酸的異源表達(dá)途徑、在tGPPS2(特異性香葉基二磷酸合酶)和月桂烯合成酶存在的條件下，大腸桿菌DH1也能夠生產(chǎn)月桂烯。通過(guò)優(yōu)化基因的表達(dá)水平、碳源、反應(yīng)介質(zhì)以及十二烷雙分子層體系，72 h后月桂烯產(chǎn)量達(dá)到58 mg/L，見表1[12]。

檸檬烯具有獨(dú)特的柑橘香味，是一種重要的日用品，可以被添加到許多清潔產(chǎn)品、化妝品和香水中。大腸桿菌中的真核甲羥戊酸類異戊二烯途徑能夠?qū)⒁阴］o酶A轉(zhuǎn)化為活化的異戊二烯單元——異戊烯基焦磷酸酯和二甲基烯丙基焦磷酸酯，它們可以相互結(jié)合、環(huán)化形成檸檬烯及其衍生物。設(shè)計(jì)和優(yōu)化該體系能夠使檸檬烯的滴定度達(dá)435 mg/L(1%的葡萄糖底物濃度)[13]。

線性單萜也可由甲羥戊酸途徑合成。 惡臭假單胞菌是具有高度溶劑耐受性的宿主生物且已被用作由甘油生產(chǎn)香葉酸的宿主。香葉酸具有甜味，木頭或樹葉氣味，并伴有淡淡的柑橘香。在香葉醇合成酶存在的情況下，惡臭假單胞菌能通過(guò)甲羥戊酸途徑生產(chǎn)香葉醇，而香葉醇可自發(fā)被氧化成香葉酸。通過(guò)優(yōu)化甲羥戊酸代謝途徑、調(diào)整反應(yīng)體系為饋料式生物反應(yīng)器，經(jīng)過(guò)2天的反應(yīng)，由4.6 g/L甘油可產(chǎn)出193 mg/L的香葉酸，見表1[14]。

5 結(jié)論

目前，認(rèn)識(shí)和發(fā)展微生物生化合成途徑已取得了一定進(jìn)展，谷氨酸、香草醛和乙醇僅是利用微生物生產(chǎn)法得以大量生產(chǎn)的幾個(gè)實(shí)例。由于香料化合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和潛在的宿主毒性，其生產(chǎn)效價(jià)仍有待提高；另外，利用微生物生產(chǎn)香料化合物的成本較高，所以我們要設(shè)法提高微生物對(duì)此類物質(zhì)的耐受性，達(dá)到足夠高的反應(yīng)效價(jià)；例如，當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物是長(zhǎng)碳鏈、化學(xué)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的化合物分子時(shí)，如何提高產(chǎn)量對(duì)我們而言則又是一個(gè)挑戰(zhàn)。

微生物法制備香料化合物具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物可降解、香味純正持久等眾多優(yōu)點(diǎn)，更符合綠色化學(xué)的時(shí)代潮流；隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展和相關(guān)合成、分離提取技術(shù)的進(jìn)一步完善,微生物生產(chǎn)法將成為更具發(fā)展前景的香料合成途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]張小舟,曾崇余,任曉乾.乙偶姻合成研究現(xiàn)狀及展望[J].江蘇化工,2001,29(2):29-31.

[2]陳元元,吳巖,劉曉光.乙偶姻生物合成代謝調(diào)控及其應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志,2014(5)：76-80,84.

[3]Nielsen D R,Yoon S H,Yuan C J,et al.Metabolic engineering of acetoin and meso-2,3-butanediol biosynthesis inE.coli[J].Biotechnol J,2010(5):274-284.

[4]Li S,Xu N,Liu L,et al.Engineering of carboligase activity reaction inCandidaglabratafor acetoin production[J].Metab Eng,2014,22:32-39.

[5]韓麗,趙祥穎,劉建軍.3-羥基丁酮的研究現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(10):116-118.

[6]Zhang X,Zhang R,Bao T,et al.The rebalanced pathway significantly enhances acetoin production by disruption of acetoin reductase gene and moderate-expression of a new water-forming NADH oxidase inBacillussubtilis[J].Metab Eng,2014,23:34-41.

[7]Goh E B,Baidoo E E,Keasling J D,et al.Engineering of bacterial methyl ketone synthesis for biofuels[J].Appl Environ Microbiol,2012,78:70-80.

[8]Goh E B,Baidoo E E,Burd H,et al.Substantial improvements in methyl ketone production inE.coliand insights on the pathway from in vitro studies[J].Metab Eng,2014,26:67-76.

[9]Rodriguez G M,Atsumi S.Isobutyraldehyde production fromEscherichiacoliby removing aldehyde reductase activity[J].Microb Cell Fact,2012,11:90.

[10]Kunjapur A M,Tarasova Y,Prather K L.Synthesis and accumulation of aromatic aldehydes in an engineered strain ofEscherichiacoli[J].J Am Chem Soc,2014,136:11644-11654.

[11]Craig T,Daugulis A J.Polymer characterization and optimization of conditions for the enhanced bioproduction of benzaldehyde byPichiapastorisin a two-phase partitioning bioreactor[J].Biotechnol Bioeng,2013,110:1098-1105.

[12]Kim E M,Eom J H,Um Y,et al.Microbial synthesis of myrcene by metabolically engineeredEscherichiacoli[J].J Agric Food Chem,2015,63:4606-4612.

[13]Alonso-Gutierrez J,Chan R,Batth T S,et al.Metabolic engineering ofEscherichiacolifor limonene and perillyl alcohol production[J].Metab Eng,2013,19:33-41.

[14]Mi J,Becher D,Lubuta P,et al.De novo production of the monoterpenoid geranic acid by metabolically engineeredPseudomonasputida[J].Microb Cell Fact,2014,13:170.