任曉曉，張小茜，張紅梅，馮玉光，董秀紅，史立宏，邵翠

（1.濰坊醫(yī)學院研究生院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院 消化內科，山東 濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學院 藥理學教研室，山東 濰坊 261053）

胃癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居前列[1]，臨床診斷時多已進入晚期，發(fā)生多臟器轉移，為延緩患者生存時間，大多以放化療替代手術治療。塞來昔布是新型環(huán)氧合酶2（cyclooxyegenase-2, COX-2）選擇性抑制劑，是非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）一種，可抑制腫瘤的生長及新生血管生成，誘導細胞凋亡，逆轉多藥耐藥（multi-drug resistance,MDR），并加強化療藥的放射敏感性和細胞毒性作用，與化、放療產生協同作用，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。筆者之前的動物實驗發(fā)現，在裸鼠體內塞來昔布能聯合氟尿嘧啶（5-Fu）協同抗腫瘤，并可降低腫瘤干細胞標記物低氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α）、ATP 結合盒基因 2（ATP-binding cassette gene 2, ABCG2）、八聚體轉錄因子4（Octamerbinding Transcription Factor 4, OCT-4）的表達，從而改善和逆轉5-Fu的化療抵抗[5]。本研究的目的是探討塞來昔布與FOLFOX4方案聯合在治療晚期胃癌中的療效，進一步研究ABCG2、OCT-4、HIF-2α與胃癌化療抵抗、多藥耐藥的關系，為晚期胃癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月-2017年5月于濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科就診經病理和電子胃鏡證實的80例晚期胃癌患者。納入標準：①晚期胃癌患者TNM分期為ⅢB期、ⅢC期或Ⅳ期；②因年齡大、心肺功能差或其他原因不能手術或拒絕手術的晚期胃癌患者。隨機分成實驗組和對照組各40例。其中，男性49例，女性31例；年齡48～90歲，平均64.3歲。

1.2 實驗試劑

兔抗人HIF-2α多克隆抗體、鼠抗人ABCG2單克隆抗體及OCT-4單克隆抗體（購于Abcam公司），PV-9000試劑盒、DAB試劑（購于北京中杉金橋有限公司），DNA Marker（購于Thermo公司），二抗（抗兔）（購于Proteintech公司），二抗（抗鼠）（購于Biosharp公司），β-actin（購于Santa公司），RIPA裂解液（購于Solarbio公司），Trizon、HiFi Script Gdna Removal cDNA Synthesis Kit、DNA marker、Taq Master Mix（購于康為世紀生物科技有限公司），上海生工生物工程股份有限公司合成PCR所需引物。

1.3 化療方案

在征得患者家屬知情同意的基礎上，實驗組應用塞來昔布聯合FOLFOX4化療方案：奧沙利鉑（OXA）85 mg/m2，靜脈滴注2 h，第1天；塞來昔布0.2 g，1次/d，口服，第1～5天；亞葉酸鈣（CF）200 mg/m2，靜脈滴注2 h，第1～2天；5-氟尿嘧啶（5-Fu）400 mg/m2，快速靜脈滴注 0.5 h，5-Fu 600 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注22 h，第1～2天。對照組用FOLFOX4方案，化療劑量及時間同治療組。每3周重復，21 d為1個周期，共用4個周期。

1.4 療效評價

每2個周期評價療效1次，若出現可能為病情進展的臨床表現可提前評價療效。所有患者進行隨訪。療程結束4周后再行電子胃鏡和上腹CT檢查。參考WHO實體瘤療效評價標準[6]：完全緩解（complete remission, CR）：病灶完全消失，維持4周以上。部分緩解（partial remission, PR）：病灶減少50%以上并維持4周以上。穩(wěn)定（stable disease, SD）：病灶縮?。?5%，或增大＜25%，無新病灶出現。進展（progressive disease, PD）：腫瘤增大超過25%，或出現新病灶。按照治療效果分為有效（包括CR和PR）與無效（包括SD和PD），疾病有效率（RR）=（CR+PR）/總例數×100%。分別檢測實驗組和對照組治療后ABCG2、OCT-4、HIF-2α的mRNA和蛋白表達。

1.5 ABCG2、OCT-4及HIF-2αmRNA表達的檢測

采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測mRNA的表達。用Trizol法提取胃癌中的RNA，以35 μl DEPC水溶解，測得各組中mRNA的濃度和純度，并將各組稀釋成相同濃度。引物序列如下：GAPDH正向5'-GCACCACCAACTGCTTAGCAC-3'，反向：5'-GCAGC GCCAGTAGAGGCAGG-3'，產物片段 143 bp；OCT-4正向：5'-CCCGAAAGAGAAAGCGAACC-3'，反向：5'-CA GAACCACACTCGGACCAC-3'，產物片段151 bp；ABCG2 正 向 ：5'-CCCTTATGATGGTGGCTTATTC-3'，反向：5'-GTGAGATTGACCAACAGACCAT-3'，產物片段132 bp；HIF-2α 正向：5'-CTTGGAGGGTTTCATTGCTG TGGT-3'，反向：5'-GTGAAGTCAAAGATGCTGTGTCCT-3'，產物片段123 bp。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃ 2 min終延伸。2%瓊脂糖凝膠電泳。應用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，以ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA灰度值與GAPDH灰度值的比值表示mRNA的相對表達量。

1.6 胃癌組織中ABCG2、OCT-4及HIF-2α蛋白表達的檢測

采用免疫組織化學（簡稱免疫組化）法。將收集到的部分胃癌組織標本用4%多聚甲醛固定，包埋切片，脫蠟入水，按照PV-9000試劑盒說明書進行操作。陰性對照用PBS代替一抗。結果判定：ABCG2和OCT-4陽性結果為細胞質內出現棕黃色顆粒，HIF-2α陽性結果為胞質內出現棕黃色顆粒，部分胞核也有少量表達。

1.7 Western blot檢測胃癌組織中HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白的表達

用RIPA裂解液提取組織中的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并將其調節(jié)成統一濃度。取6 μl蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，孵育（4℃過夜），37℃孵育1 h，TBST洗滌，X射線曝光、顯影、定影后觀察結果。應用Image J圖像分析軟件，分析HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表達，以HIF-2α、ABCG2、OCT-4灰度值與β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療效果

實驗組中有效率為77.5%（31/40），對照組有效率為42.5%（17/40），兩組比較差異有統計學意義（χ2=10.208，P=0.001）。

2.2 ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA的表達

兩組間ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA表達差異有統計學意義（HIF-2α：t=21.517，P=0.000；ABCG2：t=27.348，P=0.000；OCT-4：t=62.470，P=0.000）。實驗組低于對照組。見圖1和表1。

2.3 ABCG2、OCT-4、HIF-2α蛋白的表達

實驗組ABCG2、OCT-4及HIF-2α蛋白的較對照組降低，ABCG2和OCT-4胞質內出現棕黃色顆粒，HIF-2α胞質內出現棕黃色顆粒，部分胞核也有少量表達。見圖2～4。

2.4 胃癌組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表達

圖1 HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA在胃癌組織中的表達 （RT-PCR）

表1 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA相對表達量 （±s）

表1 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA相對表達量 （±s）

組別 HIF-2α ABCG2 OCT-4實驗組 0.471±0.025 0.500±0.018 0.456±0.007對照組 0.752±0.007 0.793±0.011 0.873±0.011 t值 21.517 27.348 62.470 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 ABCG2蛋白在胃癌組織中的表達

兩組間HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白的表達比較，差異有統計學意義（HIF-2α：t=41.306，P=0.000；ABCG2：t=56.607，P=0.000；OCT-4：t=31.048，P=0.000）。實驗組低于對照組。見圖5和表2。

圖3 OCT-4蛋白在胃癌組織中的表達

圖4 HIF-2α蛋白在胃癌組織中的表達

圖5 胃癌組織中HIF-2α、ABCG2及OCT-4 蛋白的表達 （Western blot）

表2 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白相對表達量（±s）

表2 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白相對表達量（±s）

組別 HIF-2α ABCG2 OCT-4實驗組 0.273±0.014 0.320±0.013 0.388±0.006對照組 0.678±0.009 0.818±0.008 0.538±0.006 t值 41.306 56.607 31.048 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

FOLFOX方案治療晚期胃癌的總體有效率不超過50%，中位生存期僅8.0～11.9個月[7-8]，轉移、復發(fā)率高達80%以上。許多研究表明，低氧微環(huán)境和腫瘤干細胞的存在是影響腫瘤放化療敏感性及發(fā)生、發(fā)展、轉移的重要原因[9-10]。因此研究胃癌患者的化療是目前消化道腫瘤領域研究的一大重點。有研究證明，塞來昔布能抑制COX-2通路的表達，逆轉多藥耐藥，改善腫瘤微環(huán)境，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[11-13]。塞來昔布與化療藥物的聯合應用具有協同抗腫瘤作用，可能通過抑制腫瘤細胞的增殖促進細胞凋亡[14]。本研究顯示，治療晚期胃癌時實驗組有效率高于對照組。塞來昔布聯合FOLFOX4化療影響胃癌的發(fā)展和轉移，提高患者的化療敏感性，其療效優(yōu)于單獨的FOLFOX4化療方案。

慢性缺氧通常又是實體瘤廣泛生長的原因[15]。微環(huán)境變化與缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）有關[16]。HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α 是 HIF的3個亞型，其中HIF-2α與CSCs的關系最密切，研究表明，HIF-2α通過減少OCT-4、Notch等多種干細胞通路的表達適應微環(huán)境的變化[17]。ABCG2是一種在腫瘤組織中高表達與化療耐藥相關的膜轉運蛋白超家族成員。OCT-4是一種與腫瘤耐藥相關的POU轉錄因子，其表達水平直接影響干細胞的分化方向[18-19]。多種CSCs高表達ABCG2、OCT-4和HIF-2α，CSCs的化療耐藥與HIF-2α-ABCG2和HIF-2α-OCT-4通路高表達有關[20-21]。此外研究顯示，HIF-2α可調節(jié)ABCG-2、OCT-4的產生，缺氧HIF-2α/ABCG2/MDR途徑可促進乳腺癌細胞多藥耐藥[5，22]。

本研究發(fā)現，在治療晚期胃癌時，實驗組中ABCG-2、OCT-4、HIF-2α的mRNA及蛋白表達較對照組降低，其機制可能通過降低HIF-2α-ABCG2和HIF-2α-OCT-4通路的表達，改善FOLFOX4化療方案的化療抵抗、多藥耐藥。本研究還發(fā)現，塞來昔布聯合FOLFOX4化療方案有協同抗腫瘤作用，能協同抑制腫瘤的發(fā)展和轉移，逆轉多藥耐藥，提高治療效果。本研究為晚期胃癌的聯合靶向治療提供新的思路和方法，具有良好的臨床應用前景，但仍需要進一步探索。

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