黃傳俊，楊 莉，梅 勇#，羅 磊，呂姍珊，曾博程，龍 濤，王 鳳，左 娟，袁開超，唐 攀，朱 鋒，陳波，譙志文（1.湖北省中醫(yī)院藥事部，武漢40061；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢40074；.重慶思科藥物研究所有限公司，重慶 401520）

健脾止瀉寧顆粒系國(guó)家中藥保護(hù)品種，由黨參、蓮子、白扁豆、黃連、黃芩、金銀花、山楂、車前子（鹽炙）、建曲、干姜等10味中藥材組合而成[1]，具有清熱除濕、抗炎鎮(zhèn)痛[2]、促消化、促吸收、止瀉[3-4]、增強(qiáng)免疫功能[5]和改善腸道微生態(tài)環(huán)境[6]等功效，臨床上用于治療小兒脾虛濕熱型急性腹瀉[7]、小兒遷延性腹瀉?。ㄆ⑻摑駸嶙C）[8]、潰瘍性結(jié)腸炎[9]。該藥現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[10]含量測(cè)定項(xiàng)中僅以薄層色譜法（TLC）掃描測(cè)定黃連有效成分鹽酸小檗堿的含量。方中黃連有效成分鹽酸小檗堿對(duì)細(xì)菌有明顯的抑制作用[11]；黃芩有效成分為黃酮類化合物，其中黃芩苷含量較高，具有多種生物活性，且有抑菌、抑制病毒的作用[12]。本研究以高效液相色譜（HPLC）切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定健脾止瀉寧顆粒中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量，以期為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型HPLC儀（包括在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二級(jí)管陣列檢測(cè)器、LabSolutions色譜工作站）、UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；CP225D型電子分析天平、BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

健脾止瀉寧顆粒（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170101、170501、170901，規(guī)格：3 g/袋）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：86.7%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.45%磷酸溶液-三乙胺（50∶49∶1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm（鹽酸小檗堿）、280 nm（黃芩苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加DMF 5 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min，加甲醇稀釋制成鹽酸小檗堿、黃芩苷質(zhì)量濃度均約為300 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。2.2.2 供試品溶液 取樣品0.6 g，研細(xì)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加DMF 5 mL，超聲處理5 min，放冷，加甲醇稀釋定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按健脾止瀉寧顆粒處方和工藝分別制備缺黃連、缺黃芩的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，在265 nm波長(zhǎng)處，鹽酸小檗堿色譜峰與其他色譜峰呈基線分離，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)大于4 000，分離度大于3.0；在280 nm波長(zhǎng)處，黃芩苷色譜峰與其他色譜峰呈基線分離，理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)大于6 000，分離度大于2.0。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 專屬性試驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，在與鹽酸小檗堿或黃芩苷對(duì)照品保留時(shí)間相同處，陰性對(duì)照無(wú)色譜峰干擾，表明專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以鹽酸小檗堿和黃芩苷進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿和黃芩苷回歸方程分別為y＝52 647x+930.8（r＝0.999 7）、y＝59 742x-154.9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿和黃芩苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為60.3～312.8、81.5～368.9 ng。

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得鹽酸小檗堿和黃芩苷定量限分別為0.666 8、0.774 0 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得鹽酸小檗堿和黃芩苷檢測(cè)限分別為0.222 6、0.258 0 ng。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

由不同分析人員于不同時(shí)間，精密稱取樣品（批號(hào)：170501），共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

表1 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝12）Tab 1 Results of intermediate precision tests（n＝12）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170501）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為0.90%、0.70%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：170501）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為5.73、5.36 mg/g，RSD分別為0.25%、0.60%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：170501）適量，共6份，分別加入對(duì)照品溶液（鹽酸小檗堿：1.756 mg/mL，黃芩苷：1.624 mg/mL）各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 耐用性試驗(yàn)

2.11.1 改變色譜柱 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同色譜柱[Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，詳見表3。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為5.74、5.32 mg/g，RSD分別為1.12%、1.15%，表明本色譜條件在一定色譜柱變動(dòng)情況下耐用。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of durability tests

2.11.2 改變流動(dòng)相 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同流動(dòng)相[甲醇-0.45%磷酸溶液-三乙胺比例（V/V/V）分別為50∶49∶1、48∶52∶1、52∶48∶1]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，詳見表3。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為5.75、5.35 mg/g，RSD均為0.75%，表明本色譜條件在一定流動(dòng)相變動(dòng)情況下耐用。

2.11.3 改變流速 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同流速（1.0、0.9、1.1 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，詳見表3。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為5.74、5.36 mg/g，RSD分別為0.44%、0.84%，表明本色譜條件在一定流速變動(dòng)情況下耐用。

2.11.4 改變柱溫 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同柱溫（30、25、35℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，詳見表3。結(jié)果，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為5.72、5.34 mg/g，RSD分別為0.27%、0.47%，表明本色譜條件在一定柱溫變動(dòng)情況下耐用。

2.12 樣品含量測(cè)定

取3批樣品內(nèi)容物各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Content determination results of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，筆者以鹽酸小檗堿和黃芩苷對(duì)照品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿在265 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。因此，確定鹽酸小檗堿測(cè)定波長(zhǎng)為265 nm、黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm。

在樣品提取方法上，筆者分別考察了鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）超聲處理20 min、70%乙醇溶液超聲處理30 min以及加DMF超聲處理5 min。結(jié)果，第一種提取方法提取黃芩苷含量較低，第二種方法提取鹽酸小檗堿含量較低，而采用DMF提取超聲處理對(duì)2種成分的提取效果均較好。在色譜條件的選擇中，筆者分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-磷酸溶液-三乙胺等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果采用甲醇-0.4%磷酸溶液-三乙胺（50∶49∶1，V/V/V）為流動(dòng)相時(shí)，所得目標(biāo)成分與相鄰峰之間的分離度好、峰形尖銳、對(duì)稱性好，理論板數(shù)均大于4 000，能滿足HPLC法的相關(guān)要求。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性均較好，可用于健脾止瀉寧顆粒中鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的同時(shí)測(cè)定。

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