劉麗莉，楊陳柳，李玉，梁嚴(yán)予，孟圓圓，代曉凝，陳珂

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)

我國是畜產(chǎn)品的生產(chǎn)大國，具有豐富的牛骨資源，然而只有為數(shù)有限的蛋白酶可以引起牛骨膠原蛋白的降解，導(dǎo)致長期以來，我國絕大多數(shù)牛骨資源尚未得到有效的開發(fā)利用[1-2]。如果能夠利用生物酶工程技術(shù)的優(yōu)勢，對牛骨進(jìn)行深加工，開發(fā)功能性骨蛋白肽，不僅可以解決牛骨資源浪費(fèi)問題，而且還能夠帶來一定的經(jīng)濟(jì)效益，將為我國畜禽骨骼資源的深度開發(fā)利用提供新的研究思路。牛骨骼中的膠原蛋白經(jīng)酶解后，可以得到骨膠原多肽，它不僅能夠抗氧化、抗衰老、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等，而且在營養(yǎng)吸收方面，比膠原蛋白效果更佳[3-5]。

目前有關(guān)微生物源膠原蛋白酶的產(chǎn)生菌的報(bào)道有溶組織梭菌[6],Bacillussp.MO-1[7],CandidaalbicansURM 3622[8]和VibriovulnificusCYK279H[9]等等，但是這些菌株大部分為致病菌，在產(chǎn)膠原蛋白酶時(shí)，病原菌也產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，并不適合大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前市售的膠原蛋白酶菌株及相關(guān)研究都很少[10-11]。如趙妍嫣等[12]采用胰蛋白酶作用于骨膠原，結(jié)果表明與膠原蛋白相比，酶解后的蛋白肽有更好的乳化性和溶解性； ZHANG等[13]將牛骨膠原通過6種常規(guī)蛋白酶處理與不處理進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，處理后的產(chǎn)物膠原蛋白肽可以降低血壓。但這些研究所采用的蛋白酶對骨骼的降解程度仍未達(dá)到較佳的工業(yè)利用價(jià)值。本研究以蠟樣芽胞桿菌BacilluscereusMBL13-U來源的目的基因?yàn)槟０?，成功?gòu)建出工程菌pET30a-ColM13/BL21，對工程菌表達(dá)純化出的重組膠原酶(ColM13)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并對經(jīng)BSC和ColM13處理的膠原蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)特性分析，結(jié)果表明，與BacilluscereusMBL13-U分離純化出的膠原酶(BSC)相比，ColM13對骨膠原蛋白有更好的降解效果，這為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛跟踺Ⅰ型膠原蛋白,源葉生物有限公司；工程菌pET30a-ColM13/BL21,本課題組構(gòu)建的表達(dá)膠原蛋白酶活性的菌株；茚三酮,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1650型高速冷凍離心機(jī),湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì),上海精科有限公司；UV2600型紫外可見分光光度計(jì),日本島津有限公司；Perten DA7200型FT-IR紅外光譜儀,德國Bruker公司；熒光分光光度計(jì),美國Aglient Cary Elipse公司。

1.3 方法

1.3.1 ColM13的分離純化

1.3.1.1 LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)及配制方法

向100 mL的去離子水中加入NaCl 1.0 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1.0 g，于121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻后向其中加入50 mg/mL Kana 100 μL。

1.3.1.2 ColM13的分離純化

按1%接種量將工程菌pET30a-ColM13/BL21接種至LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)，在37 ℃、180 r/min的條件下過夜培養(yǎng)。向5 mL LB培養(yǎng)液(含Kana)中加入1%培養(yǎng)物，再恒溫培養(yǎng)約3～4 h至細(xì)菌的OD600值為0.3～1.0左右。在37 ℃的培養(yǎng)條件下，向工程菌培養(yǎng)液中加入1‰ IPTG(100 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。將培養(yǎng)物以5 000g離心，時(shí)間10 min，收集沉淀。然后用配好已滅菌的800 μL PBS溶液吹打洗滌，進(jìn)行超聲波破碎后離心(破碎條件為冰浴、400 W、20 min、超聲2 s間歇3 s)，上清即為ColM13的粗酶液，然后使用Ni-NTA親和層析對ColM13進(jìn)行純化[14]。

1.3.2 ColM13最適溫度及熱穩(wěn)定性研究

分別在不同溫度下(20、30、37、40、45、50、55、60、70 ℃)測定ColM13酶活，以確定ColM13的最適溫度，將最適溫度下確定的ColM13酶活定為100%，其余溫度下測定的ColM13酶活與之相比得到相對酶活；將ColM13分別在20、30、37、40、45、50、55、60、70 ℃的條件下處理1 h，冷卻后在最適溫度下測定ColM13酶活，將未處理的ColM13酶活定為100%，其余溫度條件下測得的ColM13酶活與之相比得到相對酶活，ColM13酶活采用茚三酮顯色法進(jìn)行測定[15-16]。

1.3.3 ColM13最適pH及pH穩(wěn)定性研究

分別在pH 3.0～11.0的條件下測定ColM13酶活，以確定ColM13的最適pH，將最適pH條件下測定的ColM13酶活定為100%，其余pH值下測定的ColM13酶活與之相比得到相對酶活；將ColM13分別在pH 3.0～11.0的條件下處理1 h，然后在最適pH下測定酶活，以未處理的重組酶活作為100%，其余pH值下測得的ColM13酶活與之相比得到其相對酶活。

1.3.4 蛋白酶抑制劑對ColM13酶活性的影響

在反應(yīng)體系中加入PMSF，EDTA，EGTA和β-巰基乙醇等蛋白酶抑制劑，在最適反應(yīng)條件下測ColM13酶活力，以未添加抑制劑的ColM13酶活作為100%，加入抑制劑測得的ColM13酶活與之相比得到其相對酶活。

1.3.5 BSC的分離純化

以蠟樣芽胞桿菌BacilluscereusMBL13-U為出發(fā)菌種，從發(fā)酵制備的粗酶液中分離純化出降解骨膠原蛋白的膠原酶(BSC)，分離純化步驟參照文獻(xiàn)[17]。

1.3.6 紫外(UV)掃描分析

將骨膠原蛋白分別用BSC和ColM13進(jìn)行處理，在近紫外區(qū)對處理過的樣品進(jìn)行200～400 nm的全波長掃描。

1.3.7 差示掃描熱量(DSC)分析

將經(jīng)BSC、ColM13處理前后冷凍干燥的樣品，放入DSC鋁坩鍋中，加蓋密封鋁坩鍋后，以空鋁坩鍋?zhàn)鳛閰⒈取?0 ℃保持1 min，從30 ℃升溫到150 ℃，升溫速率為5 ℃/min，120 ℃保持1 min。

1.3.8 熒光光譜分析

將骨膠原蛋白分別用BSC和ColM13進(jìn)行處理，分別將其放入熒光分光光度計(jì)中。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，掃描波長為280～700 nm進(jìn)行掃描[18]。

1.3.9 紅外光譜分析

將一定量干燥后的KBr和經(jīng)BSC、ColM13處理前后冷凍干燥過的樣品置于瑪瑙研缽中，盡量研磨成粉末狀，裝樣，進(jìn)行手動壓片，取出樣品小心輕放入樣品室。采用傅立葉變換紅外光譜儀對樣品在400～4 000 cm-1區(qū)間掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對ColM13酶活力的影響

對ColM13在不同溫度條件(20～70 ℃)下的酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。由圖1-a可知，溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)ColM13酶活力隨著反應(yīng)溫度的升高而逐漸增高；50 ℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值；55 ℃時(shí)，酶活仍能夠保持在85%以上。繼續(xù)升高溫度，ColM13酶活力呈顯著性下降，這可能是因?yàn)檩^高的反應(yīng)溫度破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)，從而酶活力下降[19]。因此，ColM13的最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。將ColM13在不同溫度條件下溫育1 h后，測定其殘余酶活力結(jié)果如圖1-b所示，在55 ℃以下的溫度(20～55 ℃)溫育1 h后，ColM13酶活力仍能夠保持80%以上；當(dāng)溫育時(shí)的溫度達(dá)到55 ℃以上(60 ℃、70 ℃)，隨著溫度的升高，殘余的ColM13酶活力明顯下降，幾乎完全失活。因此，當(dāng)預(yù)處理的溫度低于55℃時(shí)，ColM13具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖1 溫度對重組ColM13相對酶活的影響(a)；重組ColM13的熱穩(wěn)定性分析(b)Fig.1 The influences of temperature on relative activity of recombinant ColM13(a)； Temperature stability analysis of recombinant ColM13(b)

2.2 pH對ColM13酶活力的影響

對ColM13在不同pH反應(yīng)體系(3.0～11.0)下的酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對重組ColM13相對酶活的影響(a)；重組ColM13的pH穩(wěn)定性分析(b)Fig.2 The influences of pH on relative activity of recombinant ColM13(a)； pH stability analysis of recombinant ColM13(b)

由圖2-a可知，當(dāng)反應(yīng)體系在pH 8.0時(shí)，ColM13酶活力達(dá)到最高；在偏酸、偏堿性的環(huán)境中，ColM13酶活會隨著酸堿性的增加而酶活力逐漸降低。因此，ColM13酶活的最適pH值為pH 8.0。ColM13酶活呈現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)樗?、堿環(huán)境對酶分子活性中心的催化基團(tuán)和活性基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響較大，同時(shí)影響著酶分子活性部位上的相關(guān)基團(tuán)的解離[19]。此外，將ColM13在不同pH的溶液溫育1 h，以測定其對酸、堿溶液的耐受性，殘余酶活力情況如圖2-b所示。在pH 3.0～6.0的范圍內(nèi)，隨著溶液pH值的逐漸增高，ColM13酶活力也隨之上升；在pH 6.0的條件下，酶活力達(dá)到最高；在pH 6.0～9.0的條件下處理ColM13，其酶活仍能夠保持80%以上；當(dāng)繼續(xù)升高溶液的pH，ColM13酶活開始下降，但酶活仍在30%以上，這可能是由于ColM13酶對堿性溶液呈現(xiàn)較好的耐受性。因此，在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)，ColM13具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 抑制劑對ColM13酶活力的影響

分別用1 mmol/L PMSF，EDTA，EGTA和β-巰基乙醇預(yù)處理1 h，然后測定其殘余酶活，以未加抑制劑的為對照，結(jié)果如圖3所示。

圖3 抑制劑對重組ColM13酶相對酶活的影響Fig.3 The influences of different inhibitors on relative activity of recombinant ColM13 enzyme

由圖3可知，在反應(yīng)體系中添加PMSF、β-巰基乙醇后，ColM13酶活幾乎不受影響，其酶活仍保持在80%以上；然而，添加EDTA、EGTA后，ColM13酶活在30%以下。結(jié)果表明，金屬蛋白酶抑制劑EDTA、EGTA對ColM13有顯著的抑制作用。

2.4 UV光譜分析

圖4 膠原蛋白酶解前后的紫外光譜分析Fig.4 Analysis of UV spectrum before and after enzymatic hydrolysis of collagen

2.5 DSC掃描分析

采用DSC對一定量的骨膠原蛋白和經(jīng)BSC、ColM13處理后冷凍干燥的樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 熱收縮溫度分析Fig.5 Analysis of differential scanning calorimetry

由圖5可以看出，3者的DSC熱變性溫度曲線均出現(xiàn)了明顯的放熱峰，其原因是蛋白質(zhì)受熱變性導(dǎo)致分子構(gòu)象發(fā)生了變化。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其氨基酸組成相關(guān)，疏水性氨基酸比親水性氨基酸比例高的蛋白質(zhì)一般熱穩(wěn)定較好[23]。膠原蛋白經(jīng)過BSC和ColM13處理后的熱變性溫度均升高，這是因?yàn)槊附夂蟮哪z原蛋白的球狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)被釋放出來，同時(shí)游離出脯氨酸殘基和賴氨酸殘基，從而使其熱穩(wěn)定性提高[24]。膠原蛋白經(jīng)BSC和ColM13處理后的熱變性溫度分別升高了4.75 ℃和8.25 ℃，表明ColM13處理的膠原蛋白具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.6 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸時(shí)產(chǎn)生熒光的主要原因。激發(fā)波長280 nm主要激發(fā)色氨酸和酪氨酸，激發(fā)波長293 nm僅激發(fā)色氨酸[25-26]。骨膠原蛋白中不含有色氨酸殘基，因此選擇激發(fā)波長為280 nm進(jìn)行熒光試驗(yàn)，如圖6所示。

圖6 熒光光譜分析Fig.6 Analysis of fluorescence spectroscopy

2.7 FT-IR光譜分析

骨膠原蛋白和及其降解物膠原蛋白肽的紅外光譜分析，見圖7。

由圖7可知，經(jīng)BSC和ColM13處理過的膠原蛋白的紅外圖譜幾乎相重合，說明膠原蛋白經(jīng)2種酶處理后形成的產(chǎn)物在微觀結(jié)構(gòu)上有很大的相似性。牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽的酰胺A均出現(xiàn)在3 320 cm-1附近，這是由N—H伸縮振動引起的，是蛋白的特征吸收，經(jīng)過兩種酶的降解作用，膠原蛋白肽的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，是酶解后的膠原蛋白肽中N—H伸縮振動與氫鍵形成了締合體[28]所導(dǎo)致的。兩種酶處理后的膠原蛋白肽在2 962.98 cm-1和2 960.56 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，是—CONH—的特征吸收峰；1 700～1 600 cm-1為酰胺Ⅰ帶，是由多肽骨架的—CONH—的伸縮振動引起，酶解產(chǎn)物在1 653.04 cm-1和1 653.37 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，表明酶解后產(chǎn)物為膠原多肽[29]。強(qiáng)吸收峰的原因是由于2種酶破壞了維系膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，增加了二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β3折疊等結(jié)構(gòu)的數(shù)量。1 360～1 200 cm-1為酰胺Ⅲ帶，二者在此波數(shù)范圍內(nèi)均出現(xiàn)特征吸收，為C—H伸縮振動和N—H彎曲振動所產(chǎn)生的，但是膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的吸收峰強(qiáng)度，表明在兩種酶作用下骨膠原蛋白的肽鏈發(fā)生斷裂，酶解使膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[29]。

圖7 紅外光譜圖分析Fig.7 Analysis of fourier transform infrared spectrometer

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)以課題組成功構(gòu)建的特異性降解骨膠原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21為材料，以酶活為指標(biāo)，通過研究溫度、pH、抑制劑對ColM13的影響，對工程菌所產(chǎn)ColM13的酶學(xué)特性進(jìn)行分析，得出ColM13的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為pH 8.0；其在20～55 ℃和pH 6.0～9.0范圍內(nèi)預(yù)處理后仍保持80%的酶活；PMSF、β-巰基乙醇對ColM13酶活性影響不大，金屬蛋白酶抑制劑EDTA、EGTA對ColM13有顯著的抑制作用。

[1] 安廣杰, 胡加松, 王章存,等.豬骨蛋白酶解制取多肽鈣的研究綜述[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013,28(6):27-31.

[2] 劉麗莉, 馬美湖, 余秀芳,等.膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化[J].生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(2):194-200.

[3] GELSE K, P?SCHL E, AIGNER T.Collagens-structure, function, and biosynthesis[J].Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55(12):1 531-1 546

[4] HORN M M, MARTINS V C A, PLEPIS A M D G.Interaction of anionic collagen with chitosan: effect on thermal and morphological characteristics[J].Carbohydrate Polymers, 2009, 77(2):239-243.

[5] 柳林, 韋術(shù)敏, 程仕偉,等.產(chǎn)膠原酶的琥珀葡萄球菌分離鑒定及其培養(yǎng)優(yōu)化研究[J].中國釀造, 2016, 35(1):62-67.

[6] BICSAK T A, HARPER E.Purification of nonspecific protease-free collagenase fromClostridiumhistolyticum[J].Analytical Biochemistry, 1985, 145(2):286-291.

[7] OKAMOTO M, YONEJIMA Y, TSUJIMOTO Y, et al.A thermostable collagenolytic protease with a very large molecular mass produced by thermophilicBacillussp.strain MO-1[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 57(1):103-108.

[8] LIMA C A, RODRIGUES P M B, PORTO T S, et al.Production of a collagenase fromCandidaalbicans, URM3622[J].Biochemical Engineering Journal, 2009, 43(3):315-320.

[9] KANG S I, JANG Y B, KONG C J Y.Purification and properties of a collagenolytic protease produced by marine bacteriumVibriovulnificusCYK279H[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2005, 10(6):593-598.

[10] ZHANG X X, LI Y, WANG S Y, et al.Identification of a collagenase produced byBacilluscereusR75E isolated from human colostrum[J].Applied Biochemistry and Microbiology, 2015, 51(5):511-521.

[11] 楊光垚.膠原蛋白酶的純化及其基因的克隆與表達(dá)研究[D].成都：四川大學(xué), 2004.

[12] 趙妍嫣, 胡林林, 方芳, 等.骨膠原蛋白的酶解工藝條件[J].食品科學(xué), 2010, 31(22): 153-155.

[13] ZHANG Yu-hao, MA Liang, CAI Lu-yun, et al.Effect of combined ultrasonic and alkali pretreatment on enzymatic preparation of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from native collagenous materials[J].Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 36(5): 88-94.

[14] Lee J M, Lee J, Nam G H, et al.Heterologous expression and enzymatic characterization of γ-glutamyltranspeptidase fromBacillusamyloliquefaciens[J].Journal of Microbiology, 2017, 55(2):147-152.

[15] 萬驥, 王丹, 傅婷, 等.韭菜β-木糖苷酶的分離純化與部分性質(zhì)研究[J].食品科學(xué), 2016, 37(7): 104-109.

[16] 李陳.一種新的短小芽孢桿菌膠原蛋白酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].成都: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[17] 劉麗莉.BacilluscereusMBL13-U膠原蛋白酶的分離純化及其降解動力學(xué)分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2017，43(12)：13-19.

[18] 俞園園, 劉學(xué)謙.類人膠原蛋白與Ca(Ⅱ)相互作用的熒光光譜研究[J].化學(xué)工程, 2013, 41(9):1-4.

[19] 莊志凱.凡納濱對蝦蝦頭內(nèi)源性蛋白酶分離純化與酶學(xué)特性研究[D].湛江：廣東海洋大學(xué), 2011.

[20] 溫慧芳, 陳麗麗, 白春清,等.基于不同提取方法的鮰魚皮膠原蛋白理化性質(zhì)的比較研究[J].食品科學(xué), 2016, 37(1):74-81.

[21] LIN Y K, DENG C L.Comparison of physical-chemical properties of type I collagen from different species[J].Food Chemistry, 2006, 99(2):244-251.

[22] 張曉潔, 張宇昊, 馬良,等.超聲輔助提取兔皮膠原蛋白及其理化特性[J].食品與機(jī)械, 2017, 33(1)：167-171.

[23] GHRIBI A M, GAFSI I M, SILA A, et al.Effects of enzymatic hydrolysis on conformational and functional properties of chickpea protein isolate[J].Food Chemistry, 2015, 187(11):322-330.

[24] 吳雷, 鄭娟, 劉文濤,等.雞關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)及性能表征[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(11):86-90.

[25] 魏曉芳, 劉會洲.熱變性對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及泡沫行為的影響[J].過程工程學(xué)報(bào), 2000, 21(4):379-383.

[26] 楊偉, 袁芳, 高彥祥.魚膠原蛋白肽與表沒食子兒茶素沒食子酸酯相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(1):184-188.

[27] 肖嵐, 李誠, 付剛, 等.5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究[J].食品研究與開發(fā), 2015, 36(17): 10-14.

[28] 琚海燕, 劉新華, 但衛(wèi)華, 等.牛跟腱Ⅰ型膠原纖維的微觀結(jié)構(gòu)與理化性能分析[J].功能材料, 2015(15): 15 031-15 034.

[29] 鐘朝輝, 李春美, 顧海峰,等.溫度對魚鱗膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2007, 27(10):1 970-1 976.