宋娜 白茗 王凱 李艷榮 曲秀娟 劉云鵬

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。對(duì)于晚期結(jié)腸癌患者來(lái)說(shuō)，化療聯(lián)合靶向治療是標(biāo)準(zhǔn)治療。在結(jié)腸癌的靶向藥物中，單克隆抗體主要包括抗EGFR單克隆抗體（西妥昔單抗和帕尼單抗）和抗VEGF單克隆抗體（貝伐珠單抗），而小分子抑制劑只有多靶點(diǎn)抑制劑瑞戈非尼一種，其靶點(diǎn)包括VEGFR1-3、TIE2、KIT、RET、RAF1、BRAF、PDGFR 和FGFR等［1］。靶向藥物因?yàn)榘悬c(diǎn)明確具有針對(duì)性的抗腫瘤作用，且口服方便，但因?yàn)榇嬖谀[瘤異質(zhì)性容易出現(xiàn)耐藥。除了已經(jīng)研制的靶點(diǎn)，還有很多重要的癌基因參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。因此，探索結(jié)腸癌更有效的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值。

在眾多的候選靶點(diǎn)中，跨膜酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTKs）參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤預(yù)后和藥物耐藥等方面發(fā)揮了重要作用。其中，MET受體酪氨酸激酶是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)靶點(diǎn)，其配體是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）。MET自身突變或過(guò)表達(dá)，或通過(guò)與配體結(jié)合使下游信號(hào)發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架形態(tài)結(jié)構(gòu)，以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生等生物行為過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。研究提示，在結(jié)直腸癌中，從正常的上皮細(xì)胞到腺瘤以及結(jié)直腸癌，MET表達(dá)水平是逐步升高的［3］。MET高表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后差相關(guān)［4］，HGF/MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵因素［5-6］。另外，HGF/MET信號(hào)通路也參與了結(jié)腸癌抗EGFR單克隆抗體的耐藥［7-8］。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗誘導(dǎo)相對(duì)耐藥的細(xì)胞發(fā)生MET活化，并且證實(shí)了非配體依賴的MET磷酸化參與了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥［8］。目前，MET抑制劑在晚期非小細(xì)胞肺癌和晚期胃癌等實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)中顯示了一定的療效［9-10］，因此MET抑制劑也極有可能用于結(jié)直腸的治療。

對(duì)于RAS突變的結(jié)腸癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移且預(yù)后更差，相對(duì)的靶向治療選擇也更局限［11］。在晚期非小細(xì)胞肺癌的研究中提示，MET抑制劑tivantinib聯(lián)合厄洛替尼在KRAS突變的患者中療效更好［10］，所以本研究探索了抑制MET在RAS突變型結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用。本研究選擇了4種常見(jiàn)的RAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞，應(yīng)用siRNA敲除MET蛋白表達(dá)及常見(jiàn)MET抑制劑PHA-665752，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中觀察抑制MET對(duì)于RAS突變型結(jié)腸癌中的作用，為靶向MET治療提供更多的依據(jù)。

資料與方法

一、細(xì)胞和主要試劑

人 結(jié) 腸 癌 細(xì) 胞 HCT-116、DLD-1、Lovo和HCT-15均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ug/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。PHA-665752 購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，HGF購(gòu)自美國(guó)R&D公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。鼠抗人MET、兔抗人 phospho-MET、AKT、phospho-AKT、ERK1/2、Phospho-ERK1/2和Actin 抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

二、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

在96孔板中接種HCT-116（5 000個(gè)/孔）和Lovo（8 000個(gè)/孔），設(shè)3個(gè)復(fù)孔。第二日待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的PHA-665752或進(jìn)行MET siRNA，培養(yǎng) 48 h 后加入 5 mg/mL MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后加25 ul DMSO，測(cè)定570 nm的OD 值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值－空白組OD值 ）/（對(duì)照組OD值－空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

處理細(xì)胞后加入100 μl裂解液，超聲波破碎細(xì)胞，采用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。60 V恒壓至蛋白進(jìn)入分離膠后改為120 V恒壓；采用60 V恒壓轉(zhuǎn)印3小時(shí)，5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)后封閉一抗，4 ℃搖晃過(guò)夜。第二日，TBST 漂洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，漂洗后應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯像。

四、SiRNA轉(zhuǎn)染敲除MET蛋白表達(dá)

在6孔板中接種HCT-116和Lovo，待細(xì)胞貼壁后，應(yīng)用不含血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液分別和Control siRNA/MET siRNA（5′-GCCUGAAUGAUGACAUUCU-3′）及陽(yáng)離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000配置混合液，最后將兩部分混合室溫放置20分鐘，加入含有1.5 mL不含血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液的6孔板中，作用48小時(shí)后收取蛋白樣品。

五、細(xì)胞克隆形成檢測(cè)PHA-665752對(duì)細(xì)胞克隆形成的抑制作用

在12孔板中接種300個(gè)/孔HCT-116，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的PHA-665752，14天后應(yīng)用PBS清洗，晾干后用Giemsa染色。

六、HCT-116細(xì)胞裸鼠移植瘤的成瘤實(shí)驗(yàn)

8只3周齡裸鼠飼養(yǎng)一周后，每只皮下接種HCT-116細(xì)胞2×106個(gè)/200 μl。待瘤體積長(zhǎng)到50 mm3［瘤體積=（腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2）/2］后隨機(jī)分為兩組，一組隔日給予PHA-665752 30 mg/Kg（溶于10%聚乙二醇中）腹腔注射，一組給予等量10%聚乙二醇注射，2～3天測(cè)量小鼠體重及腫瘤大小，至第4周處死裸鼠，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，稱量移植瘤重量。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞系的MET蛋白表達(dá)

選擇4種RAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞系，包括 HCT-116、DLD-1、Lovo和 HCT-15，Western Blotting檢測(cè)MET蛋白情況。結(jié)果顯示四種RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞均表達(dá)MET蛋白（圖1）。

二、siRNA敲除MET蛋白表達(dá)對(duì)RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

選擇HCT-116和Lovo細(xì)胞，應(yīng)用siRNA敲除MET蛋白，Western Blotting驗(yàn)證了敲除效率，MTT檢測(cè)了敲除MET蛋白后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。HCT-116和Lovo細(xì)胞下調(diào)MET蛋白表達(dá)后細(xì)胞存活率分別變?yōu)?0.4±4.5%和72.2±5.8%（圖2）。

三、MET抑制劑PHA-665752對(duì)RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

選擇HCT-116和Lovo細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的MET抑制劑PHA-665752作用48小時(shí)，MTT檢測(cè)PHA-665752對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)PHA-665752對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量依賴性。另外，應(yīng)用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PHA-665752對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響，結(jié)果顯示5μM PHA-665752作用HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成數(shù)目同對(duì)照組相比只有18±8%（圖3）。

四、MET抑制劑PHA-665752對(duì)HCT-116細(xì)胞移植瘤的成瘤作用影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MET抑制劑PHA-665752對(duì)RAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)作用，選擇HCT-116建立裸鼠皮下移植瘤，給予腹腔注射PHA-665752觀察皮下移植瘤成瘤大小。結(jié)果顯示 PHA-665752可明顯抑制HCT-116細(xì)胞的皮下移植瘤大小，用藥第4周的腫瘤體積為300±72 mm3，對(duì)照組為608±59 mm3（t=5.731，P=0.005）（圖4）。

五、MET抑制劑PHA-665752對(duì)增殖信號(hào)通路的影響

應(yīng)用PHA-665752預(yù)處理細(xì)胞2 h后加入HGF刺激MET信號(hào)通路活化，Western Blotting檢測(cè)MET通路主要蛋白及磷酸化表達(dá)。結(jié)果顯示HGF能明顯激活p-MET及下游p-AKT和p-ERK，而應(yīng)用PHA-665752預(yù)處理能明顯抑制HGF激活的p-MET、p-AKT和p-ERK， 提 示PHA-665752對(duì)MET/AKT/ERK信號(hào)通路有抑制作用（圖5）。

討 論

HGF/MET信號(hào)通路在多種腫瘤的增殖、存活、血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。另外，MET異常表達(dá)及活化會(huì)介導(dǎo)靶向藥物耐藥，導(dǎo)致治療失?。?2］。MET通路活化后不僅會(huì)發(fā)生下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，還會(huì)與其它跨膜RTKs發(fā)生串話，增強(qiáng)其發(fā)揮的生物學(xué)行為［13-14］。因此，在MET異常表達(dá)的腫瘤中靶向MET治療可能成為有前景的抗腫瘤療法。

圖1 4種RAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞系的MET蛋白表達(dá)量 圖2 應(yīng)用siRNA敲除MET蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。2A：在HCT-116和Lovo細(xì)胞中應(yīng)用siRNA敲除MET蛋白表達(dá)，Western Blotting檢測(cè)MET蛋白表達(dá)；2B：MTT法檢測(cè)siRNA敲除MET蛋白后對(duì)細(xì)胞增殖的作用 圖3 MET抑制劑PHA-665752對(duì)細(xì)胞增殖的影響。3A：在HCT-116和Lovo細(xì)胞中應(yīng)用不同濃度PHA-665752作用48小時(shí)，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活；3B：在HCT-116應(yīng)用不同濃度PHA-665752作用14天，染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)目 圖4 MET抑制劑PHA-665752對(duì)HCT-116裸鼠移植瘤的作用 圖5 MET抑制劑PHA-665752對(duì)MET/AKT/ERK信號(hào)通路的作用。在Lovo細(xì)胞中應(yīng)用PHA-665752預(yù)處理2小時(shí)后加入HGF，Western Blotting檢測(cè)p-MET、p-AKT和p-ERK及本底的蛋白表達(dá)

近幾年，臨床上研發(fā)了多種MET抑制劑并開展了臨床試驗(yàn)。其中比較成功的是克唑替尼（Crizotinib），它是靶向MET、ALK融合基因和ROS1的多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶，目前被批準(zhǔn)用于EML4-ALK融合的肺腺癌患者，同時(shí)可用于MET基因擴(kuò)增的肺癌患者［15］。另一種MET抑制劑（Tivantinib）聯(lián)合厄洛替尼治療二線以后非小細(xì)胞肺癌的Ⅲ期研究中，同對(duì)照組單藥厄洛替尼相比，只延長(zhǎng)了無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（3.6個(gè)月 vs 1.9個(gè)月，P＜0.001），并未提高總生存（8.5個(gè)月 vs 7.8個(gè)月，P=0.81）［16］。在結(jié)直腸癌的治療中，開展了Tivantinib聯(lián)合伊立替康和西妥昔單抗二線治療KRAS野生型患者的Ⅱ期研究，對(duì)入組的117例患者進(jìn)行分析，加入Tivantinib并未延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（8.3個(gè)月 vs 7.3個(gè)月，P=0.38），亞組分析顯示在免疫組化檢測(cè)MET高表達(dá)PTEN低表達(dá)的患者中，Tivantinib有更好的療效，但是由于患者例數(shù)較少不能得到明確結(jié)論［17］。本研究選擇RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞，因?yàn)镽AS突變的結(jié)腸癌患者預(yù)后更差，易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，且靶向治療有限，亟待研發(fā)新的有效靶點(diǎn)。在常見(jiàn)的四種RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞系中，均有MET蛋白表達(dá)。應(yīng)用siRNA敲除MET蛋白表達(dá)對(duì)RAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用可達(dá)19.6～27.8%，而應(yīng)用MET特異性抑制劑PHA-665752對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，同時(shí)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PHA-665752可有效抑制長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞克隆形成。除了體外實(shí)驗(yàn)，本研究應(yīng)用HCT-116細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，給予PHA-665752單藥腹腔注射，驗(yàn)證了PHA-665752可明顯抑制HCT-116細(xì)胞的皮下移植瘤大小。在作用機(jī)制方面，應(yīng)用MET的特異性配體HGF進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，證明了MET抑制劑可有效抑制MET/AKT/ERK信號(hào)通路，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。

本研究從體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了抑制MET對(duì)RAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，為靶向MET治療RAS突變型結(jié)腸癌患者提供了理論依據(jù)。目前關(guān)于抑制MET治療惡性腫瘤患者的臨床研究提示，并不是所有的患者對(duì)MET抑制劑有效，有限的結(jié)果提示MET基因擴(kuò)增或者M(jìn)ET蛋白高表達(dá)的患者可能對(duì)抗MET治療更有效，因此篩選出靶向MET治療的優(yōu)勢(shì)人群是下一步的研究方向。

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