張婷婷 ，王陸軍 ，郝建平 ，，王艷梅 ，王創(chuàng)云 ，李培良 ，鄧艷芳 ，周 瓊 ，李志敏 ，龐 冰 ，董永軍，裴成成，牛學(xué)謙

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031；3.山西省玉米工程技術(shù)研究中心，山西 太原 030031）

隨著人們對高品質(zhì)小麥需求的增長，品質(zhì)育種受到了更多科學(xué)家的關(guān)注。有研究表明，高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）組成是影響小麥品質(zhì)的重要因素[1-2]。當(dāng)前檢測HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE凝膠電泳和等位基因特異性擴(kuò)增（AS-PCR）[3-4]，其中，AS-PCR 方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以實(shí)時(shí)檢測，是實(shí)現(xiàn)小麥HMW-GS分子育種的有效檢測方法。而高質(zhì)量、高通量的DNA提取是實(shí)現(xiàn)HMW-GS實(shí)時(shí)檢測的前提。前人提取基因組DNA的方法主要包括傳統(tǒng)CTAB法[5-8]、SDS法[9-10]、堿裂解法[11-12]、酶解法、磁珠法[13]、硅膠柱法[14]等，這些方法多以幼葉為提取材料，存在成本高、周期長、操作復(fù)雜或質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。

本研究在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上，針對小麥種子蛋白、淀粉含量高的特點(diǎn)，結(jié)合磁珠法，旨在尋求一種操作簡便、成本低廉、產(chǎn)率和質(zhì)量穩(wěn)定的DNA提取方法，以滿足日益增加的HMW-GS高通量分子檢測的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

供試10份小麥材料（Triticum aestivum L.）均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，其品種名稱與亞基組成如表1所示。

1.2 試劑

2%CTAB裂解液，氯仿∶異戊醇（24∶1），70%乙醇，異丙醇，TE（含RNaseA），磁珠懸浮液。

表1 10份小麥材料及其亞基組成

1.3 儀器

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市第一紡織設(shè)備有限公司）；Tissuelyser-96全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海拓赫機(jī)電科技有限公司）；5810R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf艾本德股份公司）；PCR儀（德國Eppendorf艾本德股份公司）；K5600超微量紫外可見分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）；JY-SPCT君意東方水平型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Tanon 2500凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 傳統(tǒng)CTAB法 參照魏琦超等[15]的方法。

1.4.2 小麥DNA提取新方法 取1粒小麥種子，加入700 μL CTAB提取液（65℃）；粉碎成勻漿狀；將樣品放入65℃水浴鍋中，水浴30 min；加入等體積氯仿/異戊醇混合液（體積比24∶1），充分混勻3 min；4 ℃，14 000 r/min 離心 10 min，取上清；重復(fù)抽提一次；加入5 μL的磁珠懸浮提取液，混勻，靜置5 min，棄上清；用70%乙醇洗滌磁珠1～2次，風(fēng)干磁珠；加 50 μLTE（含 RNaseA），65 ℃水浴 5 min，-20℃保存。

1.4.3 DNA質(zhì)量檢測

1.4.3.1 紫外分光光度法檢測 采用紫外分光光度計(jì)測定DNA原液的濃度及其A260/230，A260/280的值。

1.4.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 取4 μL的DNA原液與2 μL的6×Loadingbuffer混合均勻，用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓100 V，電泳60 min。

1.4.4 HMW-GS分子檢測 引物1AX2*[16]序列F：5′-ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-3′；R：5′-ACCTT GCTCCCCTTGTCTTT-3′。以新方法提取的DNA為模板，對亞基2*進(jìn)行AS-PCR，擴(kuò)增程序參照孫巖等[17]的方法，并進(jìn)行了改進(jìn)，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA產(chǎn)率比較

紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示，新方法提取的DNA比對照（傳統(tǒng)CTAB法）平均產(chǎn)率降低，標(biāo)準(zhǔn)差減?。ū?）。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，對照的電泳條帶亮度比較高，差異較大（圖1），新方法提取的DNA電泳條帶相對亮度較低，但差異較?。▓D2）。2種檢測結(jié)果均證實(shí)了新方法提取的DNA產(chǎn)率降低，但穩(wěn)定性更好。

表2 分光光度計(jì)檢測結(jié)果

2.2 DNA質(zhì)量比較

從表2可以看出，對照和新方法提取的DNA的A260/280平均值均在1.8～2.0，但新方法標(biāo)準(zhǔn)差較小。從圖1，2可以看出，對照的DNA膠孔較亮，有拖尾現(xiàn)象，且條帶不整齊，而新方法提取的DNA電泳條帶清晰一致，背景噪點(diǎn)較少。因此，采用新方法提取的DNA質(zhì)量更高更穩(wěn)定。

2.3 HMW-GS分子檢測

選擇10份小麥種質(zhì)資源，采用新方法提取的基因組DNA為模板，對亞基2*進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增（AS-PCR）。電泳檢測結(jié)果（圖3）顯示，條帶清晰，片段大小為1 319 bp，這與SDS-PAGE檢測結(jié)果一致。因此，新方法提取的DNA可以用于小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）的分子檢測。

3 討論與結(jié)論

本研究對DNA提取過程進(jìn)行了改進(jìn)：樣品在CTAB裂解液的保護(hù)下直接機(jī)械粉碎破壞細(xì)胞壁，省去了液氮研磨；在沉淀DNA時(shí)，放棄加入異丙醇沉淀20 min，而采用磁珠定向吸附DNA，直接以70%的酒精洗滌。通過上述改進(jìn)，提高了DNA的質(zhì)量和穩(wěn)定性，簡化了操作，縮短了提取周期，使高通量提取成為可能。

本研究在測量DNA的A260/280值時(shí)發(fā)現(xiàn)2種方法的平均值均在理想范圍內(nèi)，雖然存在差異但不顯著，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中二者結(jié)果差異顯著，尤其傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA一致性差，而新方法提取的DNA純度高、穩(wěn)定性好。說明紫外分光光度計(jì)所測得數(shù)值相對誤差較大，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[18]。因此，在檢測DNA質(zhì)量時(shí)，建議先采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，然后以瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果。

HMW-GS分子檢測相對SSR[19]等分子標(biāo)記，對DNA質(zhì)量要求更高，本研究檢測了HMW-GS中的2*亞基，結(jié)果清晰準(zhǔn)確，證明新方法可以用于小麥HMW-GS 分子檢測[20]。

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