陳冠武 蔡 穎* 王鳳軍 周廣彪 許如蘇 蘇建暉 張崢嶸 陳冬娥

（1.汕頭出入境檢驗檢疫局 廣東汕頭 515000；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

1 前言

變形桿菌屬（Proteus）細菌包括5個種：普通變形桿菌（P．vulgaris）、奇異變形菌（P．mirabilis）、潘氏變形桿菌（P．pennea）、產(chǎn)粘液變形桿菌（P．myxofaciens）和 P．hauseri[1]。 美國藥典（USP<1111>）、歐洲藥典（EP 5.1.4）對變形桿菌屬有明確的檢測要求，我國CHINET監(jiān)測（中國細菌耐藥性監(jiān)測）也將變形桿菌屬列為監(jiān)測菌類之一。變形桿菌還是引起食源性疾病的重要病原之一[2]?！斑w徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌在合適條件下固有的生長特性，無論在國內(nèi)外微生物學(xué)經(jīng)典論著[1，3-4]，還是在文獻上[5-8]都有明確的描述，而該屬細菌也因此而命名。但經(jīng)文獻和標(biāo)準(zhǔn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)將“遷徙生長現(xiàn)象”應(yīng)用于變形桿菌屬檢測鑒定的文獻和技術(shù)規(guī)范，可能的原因是在通常的培養(yǎng)條件下，這種特性并非能夠一直表現(xiàn)得那么穩(wěn)定和典型。筆者根據(jù)經(jīng)驗積累，并通過摸索，創(chuàng)新性地開發(fā)了 “克氏雙糖鐵長斜面遷徙生長試驗”，能使變形桿菌的“遷徙生長現(xiàn)象”特性穩(wěn)定、典型表現(xiàn)，而且易于判斷。筆者采用多種細菌菌株、人工染菌模擬樣品等，驗證了該方法能夠有效地應(yīng)用于變形桿菌的初篩檢驗。

2 材料與方案

2.1 試驗材料

本研究共選用了96株實驗用菌，包括60株變形桿菌實驗菌株和36株非變形桿菌實驗菌株，其中，有購自ATCC（美國菌種保藏中心）、CMCC（中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心）、CICC（工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）、AS（中國普通微生物菌種保藏中心）菌種保藏中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株，有汕頭檢驗檢疫技術(shù)中心動檢實驗室日常檢驗分離鑒定的參考菌株和其他實驗室提供（經(jīng)鑒定）的參考菌株。變形桿菌屬實驗用菌編號在文中以“P+數(shù)字”表示代號，具體見表1；非變形桿菌實驗菌株主要選擇生化上與變形桿菌屬較為“近親”、或環(huán)境中常見菌種，以“N+數(shù)字”表示代號，具體見表2。

表2 36株非變形桿菌實驗菌株清單

2.2 主要設(shè)備與儀器、試劑

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 （上海博迅實業(yè)有限公司），CLASSⅡA/B3型生物安全柜（美國FORMA公司），HV-85型自動高壓滅菌器 （日本HIRAYAMA公司），細菌菌濁儀和VITEK 2 Compact微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）等。

克氏雙糖鐵干粉培養(yǎng)基（同時選用了3個廠家：北京陸橋技術(shù)有限公司、廣東環(huán)凱科技有限公司、青島日水生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；制成克氏雙糖鐵長斜面，在下文簡稱北克、廣克、青克）、腦心浸液干粉培養(yǎng)基（BAI）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（下文簡稱桿顯）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、血平板等均購自廣東環(huán)凱科技有限公司，API 20E生化試劑盒、氧化酶試劑、革蘭氏染色液均購自法國生物梅里埃公司，無抑菌劑、無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏（下文簡稱基質(zhì)）購自廣東金奇日化有限公司。

3 實驗方法

3.1 實驗菌株的遷徙生長試驗

（1）按標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28的要求配制克氏雙糖鐵長斜面培養(yǎng)基（底層高度約2cm、斜面長度約6cm），在2周時間內(nèi)使用。3個廠家的干粉培養(yǎng)基按配制比例制成的斜面（北克、廣克、青克）后，在斜面的底部與試管壁之間都有約100 μL冷凝液，通常放置4℃冰箱4周內(nèi)不會完全變干。

（2）所有實驗菌株均從磁珠凍存管各取1顆放入10 mL BAI中、置于 36±1℃復(fù)蘇增菌約 18 h，肉湯濁度均達2。

（3）用移液槍分別吸各菌種500 μL菌液，小心地將吸管伸入到斜面底部冷凝液中輕輕接入菌液，操作時移液槍吸頭不能碰到培養(yǎng)基，3個廠家的克氏雙糖鐵長斜面同時接種操作。置于36±1℃、培養(yǎng)24 h和 48 h。

（4）斜面菌苔的驗證：分別用接種環(huán)在所有實驗菌株的克氏雙糖鐵斜面頂往下≤1 cm位置斜面的表面做向上刮取動作2次，分別劃線接種于血平板，置于36±1℃培養(yǎng)24 h和48 h。

3.2 遷徙生長試驗的靈敏度試驗

選擇 P1、P3、P5、P7 4 株普通變形桿菌；P8、P9 2 株潘氏變形桿菌；P10、P21、P27、P28、P29、P31 6株奇異變形桿菌共12株作為代表菌株，做遷徙生長鑒定法的靈敏度試驗。

分別挑取上述12株代表菌的菌苔，各制出1.0麥?zhǔn)隙鹊木鷿嵋?，然后?0倍數(shù)稀釋，分別取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液進行檢測。按2.1的方法操作，置于36±1℃培養(yǎng)24 h。上述操作的同時，各菌株稀釋液按吸取量500 μL菌液進行菌落計數(shù)。

3.3 人工染菌模擬化妝品樣品試驗

3.3.1 檢測樣制作

選部分代表性實驗菌菌苔調(diào)制成1.0麥?zhǔn)隙染?，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[9]的增菌方法，以“無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏（基質(zhì)液）0.5 g+干擾菌N 各 50 μL+變形桿菌 P 50 μL+SCDLP 4.5 mL”混合均勻，制出若干檢測模擬化妝品樣品增菌液（詳見表3），按2.1在3種培養(yǎng)基（北克、廣克、青克）上進行遷徙生長試驗。

表3 人工染菌模擬化妝品樣品配方列表

3.3.2 斜面菌苔的驗證

按2.1的方法，分別將菌苔醮取物劃線接種于MAC、桿顯平板，36±1℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上菌落特點。

4 結(jié)果與分析

4.1 實驗菌株遷徙生長試驗

結(jié)果見表4。變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗典型結(jié)果見圖1。接種變形桿菌的克氏雙糖鐵長斜面，肉眼可見整個斜面被漫延性生長 （四周擴散）的灰白色菌苔基本覆蓋，呈陽性反應(yīng)；而接種非變形桿菌的，菌株都未表現(xiàn)出向上的蔓延生長，有個別菌株出現(xiàn)了沿斜面向上浸潤生長 （液體附在固體表面上的漸漸滲入）的現(xiàn)象，其向上生長的菌苔沒有超過冷凝液面上1 cm（低于1/4斜面高度），呈陰性反應(yīng)。陽性與陰性的遷徙試驗結(jié)果區(qū)分度明顯。

（續(xù)表4）

圖1 變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗典型結(jié)果

斜面菌苔的驗證結(jié)果：培養(yǎng)24 h、48 h后，在所有變形桿菌實驗菌株的血平板上均出現(xiàn)覆蓋膜樣生長的菌苔，并有惡臭味，所有非變形桿菌實驗菌株的血平板上均無菌生長。

4.2 遷徙生長試驗的靈敏度試驗

遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果見表5。其中，P9號菌株遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果見圖2。由表5可見，在菌落計數(shù)為10 CFU/500 μL以下時，遷徙生長試驗仍能呈現(xiàn)陽性結(jié)果。

表5 遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果（CFU/500 μL）

圖2 P9號菌株遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果

4.3 人工模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

4.3.1 試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表6、圖3。由表6、圖3可見，干擾菌對模擬樣品中變形桿菌遷徙試驗結(jié)果沒有影響。

表6 人工染菌模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

圖3 人工模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

4.3.2 斜面菌苔驗證結(jié)果

12個樣品劃線接種于MAC、桿顯平板培養(yǎng)24 h后，生長良好，在MAC平板上均為形態(tài)一致的無色半透明或透明、圓形菌落，大小1～2 mm，菌落生長處平板顏色由桔黃色變無色；在桿顯平板上均為形態(tài)一致的桔黃色至淺褐色菌落，大小1～3 mm，菌落生長處的培養(yǎng)基有的會變成黃色。經(jīng)生化鑒定分離菌都符合所加入的變形桿菌生化特征。

5 結(jié)論與討論

《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版[3]中第八部分腸桿菌科變形菌屬中，雖然沒有將“遷徙生長現(xiàn)象”在變形菌屬予以描述，但手冊的補充評注中將普通變形桿菌（P．vulgaris）和奇異變形桿菌（P．mirabilis）清楚描述“在固體培養(yǎng)基上有顯著的自發(fā)群集的特性；運動細胞的一薄層以旋轉(zhuǎn)和帶狀的改變排列……”；雖然該版本將沒有“遷徙生長現(xiàn)象”特性的摩氏變形桿菌、無恒變形桿菌、雷氏變形桿菌也劃歸為變形桿菌屬，但作為《伯杰氏細菌鑒定手冊》更新版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》第2版[4]，將他們同時分別歸類為摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、雷特菌屬，稱為同模式異名（homotypic synonym）。本研究結(jié)果顯示這種“遷徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌屬中普通變形桿菌、奇異變形菌、潘氏變形桿菌固有的，與其他細菌明顯不同的特征性特點。

本試驗應(yīng)用克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶葡萄糖為10∶1）而沒有應(yīng)用TSI三糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶蔗糖∶葡萄糖為10∶10∶1），是因為后者比前者多含蔗糖，普通變形桿菌和潘氏變形桿菌都能分解蔗糖使斜面變黃、部分菌株除產(chǎn)硫化氫還會出現(xiàn)底層培養(yǎng)基離底，而奇異變形桿菌因不能分解蔗糖斜面為橘紅色或紅色；在克氏雙糖鐵上3種變形桿菌在斜面上都是一致的橘紅色或紅色，底層產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫但不會出現(xiàn)離底或培養(yǎng)基破裂的現(xiàn)象。本試驗也沒有像文獻[10]那樣采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面，因為變形桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂斜面上沒有糖發(fā)酵及產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫特點，而且沿斜面產(chǎn)生菌苔遷徙生長沒有克氏雙糖培養(yǎng)基明顯，對于變形桿菌的鑒定效果不好。因此，本文最終選擇應(yīng)用克氏雙糖鐵斜面作為檢測載體。為了防止國產(chǎn)試劑配方差異導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，選用國內(nèi)市場占有率較高的3個廠家的克氏雙糖試劑制成斜面，同時進行以上3個實驗。結(jié)果表明，所有變形桿菌實驗菌株均從斜面底的冷凝液中向上長出灰白色菌苔，并沿斜面向上蔓延生長，可覆蓋整個斜面，且“動力十足”地向下往斜面底層生長并產(chǎn)硫化氫，為遷徙生長試驗陽性；非變形桿菌實驗菌株中，多數(shù)未出現(xiàn)肉眼可見的向上生長現(xiàn)象，個別出現(xiàn)輕微向上浸潤生長現(xiàn)象 （液體附在固體表面上的漸漸滲入現(xiàn)象），且不會超過冷凝水液面之上1 cm（小于斜面高度1/4位置），遷徙生長現(xiàn)象均呈陰性。遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果表明，檢測低限可至少達到 3～7 CFU/500 μL，與文獻中 PCR 檢測方法相當(dāng)[11]。

變形桿菌屬細菌遷徙生長的影響因素與特定的酸堿度環(huán)境等有關(guān)，它的螺紋遷徙生長現(xiàn)象產(chǎn)生可能與其遺傳特性和地球的自轉(zhuǎn)有關(guān)[8]、瓊脂濃度和表面水分含量有關(guān)[6]、與細菌的傳代次數(shù)無關(guān)[7]、35℃、培養(yǎng)4 h就能開始遷徙生長[12]。實驗結(jié)果顯示，在克氏雙糖鐵長斜面36±1℃、培養(yǎng)24 h，變形桿菌能很好地顯示其遷徙生長特性。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)用本研究開發(fā)的克氏雙糖鐵遷徙生長試驗方法，能充分展示變形桿菌的遷徙生長特性，并且能方便、明顯地與其他細菌區(qū)分出來。人工染菌模擬樣品試驗結(jié)果表明，將化妝品樣品的首次增菌液按本文方法進行遷徙生長試驗，可以很方便地篩查出樣品中含有的微量變形桿菌。所以，遷徙生長現(xiàn)象可應(yīng)用于實際樣品檢測。本文首創(chuàng)的“遷徙生長試驗”可應(yīng)用于食品、化妝品等樣品變形桿菌的初篩檢測，既可以首次增菌液是否產(chǎn)生遷徙生長現(xiàn)象作為是否含有變形桿菌的初篩判斷依據(jù)之一，也可以在細菌分純培養(yǎng)后的遷徙生長試驗陽性作為變形桿菌的特征性生化鑒定項目之一。

本研究首創(chuàng)的“遷徙生長試驗”操作簡單、成本低廉、易于判斷結(jié)果，可作為變形桿菌屬檢測的初篩項目或特征性生化鑒定項目之一。

致謝：向為本試驗提供部分實驗菌種的天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所和深圳龍崗區(qū)疾控中心表示衷心感謝！

[1]周庭銀，倪語星.臨床微生物學(xué)診斷與圖解（第3版）[M].上海：科學(xué)出版社，2012.

[2]向輝，劉鋼，李標(biāo)，等.廣州市天河區(qū)2005-2012年食源性疾病發(fā)生原因與流行病學(xué)特征分析 [J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，（24）：4552-4555.

[3]RE 布坎南.伯杰氏細菌鑒定手冊（第8版）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[4]George M Garrity，Julia A Bell，Timothy G Lilburn.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[M].2nd Edition.New York：Springer，2004.

[5]封會茹，董曉根，趙偉，等.變形桿菌菌落計數(shù)方法的探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，（01）：126-129.

[6]何先元，廖已祥，劉俊康，等.奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現(xiàn)象研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2015，32（1）：131-136.

[7]趙振鵬，楊振，林偉東，等.豬源奇異變形桿的分離鑒定及集群運動分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（10）：219-223.

[8]李進芬.普通變形桿菌形成遷徙現(xiàn)象方法的改進[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1990，7（1）：53.

[9]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[EB/OL]．（2015-12-23），［2017-02-28］.http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/index_11.html.

[10]封會茹，董曉根，趙偉，等.變形桿菌菌落計數(shù)方法的探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，（01）：126-129.

[11]林紅樂，文嵐，張如勝.PCR快速檢測奇異變形桿菌的研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，16（2）：560-562.

[12]張秀珍，朱德妹，陳東科，等.臨床微生物檢驗問與答（第2版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014.