雷昌斌 王 東 曹錫文 唐新文 陳占昆

(1 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，郴州 423000；2 Ferguson Lab University of Pittsburgh，Pittsburgh 15213；3 北京大學(xué)人民醫(yī)院關(guān)節(jié)病研究所，北京100044)

骨性關(guān)節(jié)炎 (osteoarthritis, OA) 指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疾病[1]。隨著人口老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響人們?nèi)粘Ｉ?。?jù)統(tǒng)計在美國OA是導(dǎo)致50歲以上老年人喪失勞動力的第二主要病因，僅次于心血管疾病[2]。OA早期的治療方式包括非甾類抗炎藥、局部理療、玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射及局麻藥物注射治療[3]。目前較為前沿的研究包括使用間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesechymal stem cells, MSCs)[4]及富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)[5]治療骨性關(guān)節(jié)炎。局麻藥物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射被廣泛用于骨性關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后的疼痛緩解，常用的局麻藥有利多卡因及布比卡因[6]。有些體外研究顯示，局部麻醉藥物對動物和人類的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有毒性作用[7,8]；Hansen[9]認(rèn)為膝關(guān)節(jié)鏡術(shù)后使用關(guān)節(jié)內(nèi)鎮(zhèn)痛泵與術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨變性破壞及骨質(zhì)松質(zhì)有關(guān)。但是Iwasaki[10]的研究卻表示0.5%布比卡因連續(xù)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對小鼠正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷很小。目前局麻藥物的軟骨細(xì)胞毒性機(jī)制仍未得到很好的闡述。

本研究在前期已經(jīng)建立類似于體內(nèi)生理環(huán)境的關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進(jìn)行利多卡因及布比卡因?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的濃度及時間依賴性毒性作用，以及局麻藥對正常及損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞毒性作用的對比研究。

方 法

1.一般資料

本實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會審查，標(biāo)本取自骨性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)置換女性病人關(guān)節(jié)軟骨，病人術(shù)前簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女性；②年齡：55～65歲；③骨性關(guān)節(jié)炎；④股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨磨損；②其它類型引起的膝關(guān)節(jié)退變；③合并其它基礎(chǔ)疾病。病人接受膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)后，從手術(shù)室取回膝關(guān)節(jié)置換切除股骨外髁關(guān)節(jié)軟骨部分，離體后立即放置在磷酸緩沖鹽溶液 (phosphate buffer saline, PBS)液中浸泡，反復(fù)沖洗后，30分鐘內(nèi)在超凈工作臺上用環(huán)鉆取直徑4 mm的圓形新鮮全層厚度的正常軟骨，膝關(guān)節(jié)軟骨表面損傷組(后文簡稱損傷組)切除關(guān)節(jié)軟骨表面1mm厚度制作損傷模型，將其分別培養(yǎng)在2.5 ml含 90%DMEM (dulbecco' s modified eagle medium) / F12(1:1)，10%FBS (fetal bovine serum)，1%P/S (Penicillin/Streptomycin) 的24孔板中，置放于37℃ 和5% CO2的培養(yǎng)箱。

2.儀器設(shè)備

5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱、清潔操作臺、病理切片機(jī)及熒光顯微鏡。

3.試劑

培養(yǎng)基：90% DMEM /F-12 (1X) 購買來自美國Life Technologies公司，10% FBS購買來自美國ATLANTA 公司，1%P/S。

MTT (Methyl Thiazolyl Tetrazolium, MTT)，全稱為3- (4,5-二甲基噻唑-2) -2,5二苯基四氮唑溴鹽。規(guī)格：1 g；型號：M-5655；生產(chǎn)商: SIGMA。

DAPI：(4',6-diamidino-2-phenylindole)即 4',6-二脒基-2-苯基吲哚. 規(guī)格：2 ml；型號：P36935；生產(chǎn)商：Invitrogen。

4. 實(shí)驗(yàn)分組（每組3例）

（1）利多卡因、布比卡因?qū)φｊP(guān)節(jié)軟骨毒性的濃度效應(yīng)：吸出培養(yǎng)基后，濃度效應(yīng)組將體外正常關(guān)節(jié)軟骨分別浸泡在2.5 ml的濃度為1%和2%利多卡因、0.25%和0.5%布比卡因溶液中1 h，兩組的陰性對照均為0.9%生理鹽水，評估不同作用濃度的局麻藥物對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響。

（2）利多卡因、布比卡因?qū)φ＜皳p傷關(guān)節(jié)軟骨毒性的時間效應(yīng)：時間效應(yīng)組將正常關(guān)節(jié)軟骨和表膜損傷關(guān)節(jié)軟骨分別浸泡在2.5 ml的濃度為1%利多卡因及0.25%布比卡因溶液中30、60和120 min，兩組的陰性對照均為0.9%生理鹽水。評估利多卡因及布比卡因?qū)浌羌?xì)胞活性的時間效應(yīng)，評估局麻藥物對正常及損傷關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞毒性差異性。

（3）關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性測定：將經(jīng)過不同濃度和時間局麻藥作用過的關(guān)節(jié)軟骨，吸出局麻藥，加入2.5 ml濃度為1 mg/ml的MTT試劑中培養(yǎng)箱放置2 h染色，然后用OCT (Tissue OCT-Freeze Medium)包埋軟骨組織，將關(guān)節(jié)軟骨在冰凍切片機(jī)上制作成7 μm厚的冰凍切片，最后進(jìn)行DAPI染色。通過MTT方法檢測活細(xì)胞數(shù)，核熒光DAPI染色法確定總細(xì)胞數(shù)。活性細(xì)胞可將MTT轉(zhuǎn)化成藍(lán)紫色顆粒而死亡細(xì)胞無轉(zhuǎn)化能力，僅表現(xiàn)為淡黃色顆粒，同一顯微鏡光鏡下確定活細(xì)胞數(shù)，熒光鏡下確定總細(xì)胞數(shù)，并定量計算活細(xì)胞數(shù)百分比(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，以評估不同局麻藥對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響以及關(guān)節(jié)軟骨表膜對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。每個獨(dú)立的樣本MTT染色后切三張冰凍切片，DAPI染色后讀片。

5. 統(tǒng)計方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析采用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，將所有回收的資料統(tǒng)一編號后，采用Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計分析。以α = 0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P值取雙側(cè)概率，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計推斷。評估利多卡因、布比卡因在不同濃度和作用時間對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響是否有統(tǒng)計學(xué)差異，評估局麻藥對正常組及損傷組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞毒性的差異性。

結(jié) 果

1.利多卡因、布比卡因?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的濃度效應(yīng)

濃度效應(yīng)組中藥物作用時間固定為1 h，1%和2%利多卡因作用下的軟骨細(xì)胞活性分別為80.9 ± 1.3%和72.1±1.0%；0.25%和0.5%布比卡因細(xì)胞活性分別為78.4±2.5%、70.4±1.0%（見圖1）。關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞活性隨著利多卡因及布比卡因的濃度增加而下降，并且1%利多卡因組與0.25%布比卡因組、2%利多卡因組與0.5%布比卡因組比較存在顯著性差異(P ＜ 0.05)，結(jié)果表明局麻藥對膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞毒性作用有濃度效應(yīng)。并且1%利多卡因?qū)浌羌?xì)胞毒性小于0.25%布比卡因，2%利多卡因?qū)?xì)胞毒性小于0.5%布比卡因。

2. 1%利多卡因?qū)w外正常及損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的時間效應(yīng)

將模型分別浸泡在含有1%利多卡因溶液中30、60和120 min后，正常組軟骨細(xì)胞活性在下 降 為 79.1±1.5%、69.8±3.1%、56±10.7%； 損傷關(guān)節(jié)軟骨組則下降為76.5±1.5%、66.9±3.9%、52.2±10.7%；對照組為0.9%生理鹽水處理后細(xì)胞活性分別為92.0 ± 1.7%、90.0±2.3%、89.6±3.1%（見表1）。隨著局麻藥作用時間延長，軟骨細(xì)胞活性降低，不同濃度之間各組統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P ＜ 0.05)。浸泡30 min后，正常組比損傷組的軟骨細(xì)胞活性高，差異有顯著性(P ＜ 0.05)。但浸泡在60 min及120 min時，兩組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞ 0.05)。

3. 0.25%布比卡因?qū)φ＜皳p傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的時間效應(yīng)

將模型分別浸泡在含有0.25%布比卡因溶液中培養(yǎng)30、60、120 min后，正常組軟骨細(xì)胞活性為88.2±4.7%、78.7±3.6%、63.7±3.7%；損傷組為79.7±2.2%、71.4±4.1%、56.5±6.5%（見表2）。隨著布比卡因暴露時間的延長，軟骨細(xì)胞活性下降。在正常組與損傷組對比中，暴露30、60 min時比較存在顯著性差異(P ＜ 0.05)。但正常組與損傷組暴露在局麻藥120 min時，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＞ 0.05)。

圖1 不同濃度利多卡因和布比卡因?qū)w外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響陰性對照組為0.9%生理鹽水，* P ＜ 0.05，** P ＜ 0.01Fig.1 The dose-dependent effects of lidocaine and bupivacaine on the cell viability of articular cartilage Negative control: 0.9% saline，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01.

討 論

近年來隨著我國進(jìn)入老年社會，骨性關(guān)節(jié)炎已經(jīng)成為骨科門診常見病。在歐洲有7 000多萬OA病人，每年直接醫(yī)療成本超過20億歐元[3]。骨性關(guān)節(jié)炎的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性的侵蝕、退化、變性以及繼發(fā)性的骨贅形成，包括軟骨、滑膜、半月板及周圍韌帶和肌肉的綜合退變。關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)支配，也沒有血管和淋巴管，因此損傷的軟骨細(xì)胞溶解是不可逆并且無法完全醫(yī)治[11]。

骨性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生的炎癥因子可破壞關(guān)節(jié)軟骨的合成及分解代謝，早期的骨性關(guān)節(jié)炎傳統(tǒng)治療除了功能鍛煉及控制體重外還包括非甾類抗炎藥、玻璃酸鈉、局麻藥注射治療及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)[3]。Borakti[4]通過對MSCs治療文獻(xiàn)的Mate分析，發(fā)現(xiàn)MSCs較對照組疼痛明顯改善，并且無嚴(yán)重并發(fā)癥。Legndre[12]則指出通過重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Recombinant Human Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2) 和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)可在膠原支架中誘導(dǎo)MSCs的軟骨形成和分化。在美國有大量的運(yùn)動員通過血小板血漿(Platelet-rich plasma, PRP)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療早期膝關(guān)節(jié)退變[5]。但目前這兩種方式尚處在研究階段，局麻藥注射治療仍廣泛應(yīng)用于臨床。

表1 1%利多卡因30、60、120 min組對正常和損傷關(guān)節(jié)軟骨活性影響，陰性對照組為0.9%生理鹽水 (n = 3,±SD)Table 1 The effects of 1% lidocaine for different durations (30, 60 and120 min) in normal and injury Articular cartilage, Negative control: 0.9% saline (n = 3,±SD)

表1 1%利多卡因30、60、120 min組對正常和損傷關(guān)節(jié)軟骨活性影響，陰性對照組為0.9%生理鹽水 (n = 3,±SD)Table 1 The effects of 1% lidocaine for different durations (30, 60 and120 min) in normal and injury Articular cartilage, Negative control: 0.9% saline (n = 3,±SD)

*P ＜ 0.05，30 min組與60 min ,及60 min比120 min組相比, 30 min group compared with 60 min, and 60 min group compared with 120 min；#P ＜ 0.05，正常組與損傷組比較，Normal group compared with Injury group.

時間Time正常組Normal group損傷組Injury group對照組Control group 30 min 79.1±1.5%*# 76.5±1.5%* 92.0±1.7%60 min 69.8±3.1%* 66.9±3.9%* 90.0±2.3%120 min 56±10.7% 52.2±10.7% 89.6±3.1%

表2 0.25%布比卡因30 、60 、120 min組對正常和損傷關(guān)節(jié)軟骨活性影響，陰性對照組為0.9%生理鹽水 (n = 3,±SD)Table 2 The effects of 0.25% bupivacaine on normal and injury Articular cartilage in (30, 60 and 120 min) (n = 3,±SD)

表2 0.25%布比卡因30 、60 、120 min組對正常和損傷關(guān)節(jié)軟骨活性影響，陰性對照組為0.9%生理鹽水 (n = 3,±SD)Table 2 The effects of 0.25% bupivacaine on normal and injury Articular cartilage in (30, 60 and 120 min) (n = 3,±SD)

*P ＜ 0.05, 30 min組與60 min ,及60 min比120 min組相比, 30 min group compared with 60 min, and 60 min group compared with 120 min；#P ＜ 0.05，正常組與損傷組比較，Normal group compared with Injury group.

時間Time正常組Normal group損傷組Injury group對照組Control group 30 min 88.2±4.7%*# 79.7±2.2%* 92.0±1.7%60 min 78.7±3.6%*# 71.4±4.1%* 90.0±2.3%120 min 63.7±3.7% 56.5±6.5% 89.6±3.1%

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，局麻藥對體外關(guān)節(jié)軟骨培養(yǎng)模型處理后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性下降，并隨著利多卡因及布比卡因濃度的增高，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性下降更顯著。Buchko[13]研究顯示，46例行前交叉韌帶重建術(shù)后病人使用布比卡因和激素后13例 (23%) 病人出現(xiàn)軟骨溶解。其中0.5%布比卡因處理軟骨細(xì)胞溶解占37.5%，0.25%布比卡因處理軟骨細(xì)胞溶解約占7.1%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Breu[14]通過局部麻醉劑對軟骨細(xì)胞分化前后人間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的細(xì)胞毒性效應(yīng)的調(diào)查顯示，局麻藥對軟骨細(xì)胞的毒性效應(yīng)具有時間和濃度依賴性，并指出關(guān)節(jié)損傷、骨性關(guān)節(jié)炎或外科手術(shù)引起氧化應(yīng)激損害MSC細(xì)胞功能，甚至可能增加MSC對局部麻醉劑的脆弱性。Piat及Lo在動物體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)局麻藥對軟骨細(xì)胞具有毒性作用[15,16]。Dong[17]在大鼠髓鞘注射模型中證實(shí)，布比卡因相對于利多卡因的半衰期長，并且神經(jīng)毒性低，因此目前布比卡因比利多卡因更常用于慢性腰背部疼痛的封閉治療。關(guān)節(jié)腔內(nèi)沒有血管組織，代謝較慢，延長了布比卡因的半衰期從而增加了細(xì)胞毒性。本研究也發(fā)現(xiàn)布比卡因較利多卡因?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨毒性作用強(qiáng)。

局麻藥除了對神經(jīng)系統(tǒng)作用外，對炎癥反應(yīng)及凝血系統(tǒng)均有影響[18]。關(guān)于局麻藥物對關(guān)節(jié)軟骨的毒性作用機(jī)制主要包括以下四點(diǎn)。首先，局部麻醉藥會破壞細(xì)胞膜，引起軟骨急性壞死。第二，它們可以通過破壞線粒體跨膜電位并使氧消耗阻止ADP轉(zhuǎn)化為ATP而減緩線粒體呼吸[11]。第三，局麻藥還可以阻斷鉀和鈣離子通道，誘導(dǎo)線粒體生產(chǎn)活性氧引起脂類、蛋白質(zhì)和核酸的損害，這種惡性循環(huán)隨著時間的推移，導(dǎo)致線粒體DNA損傷和突變，使細(xì)胞功能衰竭和細(xì)胞死亡[19,20]。第四，關(guān)節(jié)軟骨的凋亡程序啟動后，將不可逆，因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨沒有巨噬細(xì)胞，壞死和凋亡殘余物可能不會被清除，并且導(dǎo)致再生組織的損傷、凋亡[21]。

本研究顯示隨著體外關(guān)節(jié)軟骨在局麻藥暴露時間的延長，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的活性隨之下降。并且在暴露30 min組，損傷關(guān)節(jié)組軟骨細(xì)胞較正常組軟骨細(xì)胞下降更明顯。因此相對正常軟骨，膝關(guān)節(jié)炎的退變軟骨更容易受到局麻藥物的侵蝕。但是軟骨暴露在60 min及120 min組，正常軟組組與損傷組差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膜對高濃度局麻藥抵抗力差，局麻藥更容易浸潤到深層軟骨，故長時間浸泡差異性不顯著。Chu[22]發(fā)現(xiàn)用0.5%布比卡因作用膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨45%軟骨細(xì)胞死亡，當(dāng)切除關(guān)節(jié)軟骨表明保護(hù)膜死亡細(xì)胞甚至達(dá)75%。進(jìn)一步證實(shí)關(guān)節(jié)表面軟骨損傷后，局麻藥可更直接和深入破壞軟骨細(xì)胞。退變骨性關(guān)節(jié)炎引起關(guān)節(jié)表面破壞，使細(xì)胞外基質(zhì)及數(shù)量減少，提高了局麻藥物的擴(kuò)散及浸潤能力。使局麻藥物能進(jìn)入更深及更廣泛的軟骨區(qū)域引起軟骨細(xì)胞壞死。

本研究采用老年病人膝關(guān)節(jié)置換軟骨建立體外培養(yǎng)器官模型，較以往的動物模型或軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，可以更好的模擬組織在體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)和正常營養(yǎng)物質(zhì)的彌散交換，但是與人體關(guān)節(jié)系統(tǒng)的新陳代謝仍有較大差距。下一步擬繼續(xù)通過Wosternblot檢測不同局麻藥及濃度處理后關(guān)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖及I型膠原的改變，及通過ATP檢測軟骨細(xì)胞能量代謝的改變。根據(jù)本研究及以往研究結(jié)果，局麻藥在臨床上廣泛應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)炎和膝關(guān)節(jié)鏡術(shù)后鎮(zhèn)痛的同時，其對關(guān)節(jié)軟骨的毒副作用應(yīng)當(dāng)受到重視。由于局麻藥的毒性作用具有濃度和時間依賴性，臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎使用大劑量和長療程局麻藥物。

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