張家君 岳 偉 張燦文 胡冬梅 袁 慧 楊明峰 牛敬忠 張顏波△

（1泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，泰安271000；2泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科，泰安，271000；3泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，泰安 271000）

與軀體痛比較，內(nèi)臟炎癥痛缺少特異、有效的治療藥物，所以探索、研發(fā)新型、有效的內(nèi)臟炎癥痛鎮(zhèn)痛藥物迫在眉睫[1]。痛覺(jué)敏感化包括痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)異常等，影響著內(nèi)臟炎癥痛的形成和維持，在痛覺(jué)調(diào)制中發(fā)揮重要作用，是內(nèi)臟炎癥痛關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[2,3]，眾多神經(jīng)遞質(zhì)、通道和受體等信號(hào)通路參與內(nèi)臟炎癥痛痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程，導(dǎo)致內(nèi)臟炎癥痛“痛覺(jué)敏感化”。痛覺(jué)敏感化將是內(nèi)臟炎癥痛新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)方向[1,4]。MAPKs通路包括MAPKERK通路、MAPKJNK通路、MAPKP38通路和MKK5/MAPKERK5 共4條通路，研究發(fā)現(xiàn)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)P38、ERK激活，參與內(nèi)臟痛形成與維持的痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程；與ERK、P38激活通路相比，JNK作為一種應(yīng)激激活的蛋白激酶在病理性痛覺(jué)敏感化中研究相對(duì)較少，在內(nèi)臟炎癥痛覺(jué)敏感化中的作用研究更少[5～7]。故本實(shí)驗(yàn)擬用福爾馬林直腸粘膜下復(fù)制內(nèi)臟炎癥痛模型[8]，經(jīng)脊髓蛛網(wǎng)膜下腔插管給予JNK抑制劑SP600125，觀察JNK抑制劑對(duì)內(nèi)臟炎癥痛疼痛評(píng)分和脊髓背角神經(jīng)元電活動(dòng)的影響，探索JNK抑制劑對(duì)內(nèi)臟炎癥痛痛覺(jué)敏感化的作用，以期進(jìn)一步探討內(nèi)臟炎癥痛治療的分子靶點(diǎn)。

方 法

1.試劑與材料

SP600125（美國(guó)Santa Cruze公司），福爾馬林、乙醚和戊巴比妥鈉（北京西中化工廠），PE-10管（ID:0.28mm; OD:0.61mm, Becton Dickinson公司），有機(jī)玻璃行為學(xué)觀察箱（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究室制），大鼠手持直腸窺器（專利號(hào)：CN200820173538.2），鎢絲電極(3～5MΩ，William D.Willis教授捐贈(zèng))、多導(dǎo)電生理記錄儀（MP150型）（美國(guó)Biopac公司）。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用清潔級(jí)雄性SD大鼠，重200～250 g，山東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (魯) 2005-0015。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組：福爾馬林(formalin, F)直腸致炎組（F組）；福爾馬林直腸致炎和脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管（intrathecal, IT）組（IT組）；福爾馬林直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射生理鹽水組（NaCl組）;福爾馬林直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射SP600125組（SP600125組）；每組大鼠12只，共48只。

3.脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管及給藥

根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[8,9]，用PE-10管插入大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，插入長(zhǎng)度7.5 cm，外端留有4.5 cm左右。本實(shí)驗(yàn)中NaCl和SP600125組，分別在福爾馬林直腸致炎前30min經(jīng)PE-10插管注射 20 μl 0.9%lNaCl、20 μl SP600125 溶液（含 10 μg SP600125），然后注入10 μl 0.9% NaCl沖洗插管，保證注射藥品全部進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。

4.內(nèi)臟炎癥痛模型復(fù)制

根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[8,9]，大鼠乙醚持續(xù)麻醉，經(jīng)肛門插入自制的直腸窺器（專利號(hào)：CN200820173538.2），距肛門約35 mm處，用針長(zhǎng)8 cm的1 ml注射器于直腸粘膜下注射100 μl 5%的福爾馬林。

5.內(nèi)臟痛行為學(xué)觀察

福爾馬林致痛后，大鼠共有4種疼痛行為：①舔腹(L)；②伸腰(B)；③側(cè)扭(C)；④全身收縮(W)。疼痛評(píng)分公式計(jì)算：S = 1L + 2B + 3C +4W。L，B，C和W代表在一段時(shí)間內(nèi)相應(yīng)行為的次數(shù)。4組大鼠，每組8只，每15 min進(jìn)行一次疼痛計(jì)分，連續(xù)記錄大鼠的行為120 min[8,9]。

6.脊髓背角神經(jīng)元放電記錄

根據(jù)我們既往成熟方法進(jìn)行脊髓背角神經(jīng)元電生理記錄[8,9]。SD大鼠以40 g/L的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用鎢絲電極(3～5 MΩ)，在L6～S1背角處進(jìn)行胞外記錄，通過(guò)對(duì)直結(jié)腸擴(kuò)張性刺激敏感性不同鑒別出廣動(dòng)力范圍神經(jīng)元，神經(jīng)信號(hào)通過(guò)多導(dǎo)電生理記錄儀記錄并分析。以15 min為單位分析神經(jīng)元放電頻率，福爾馬林注射前神經(jīng)元放電頻率為基線，即100%，注射后的放電頻率以其占基線的百分比表示。觀察記錄注射福爾馬林后120 min內(nèi)脊髓背角神經(jīng)元放電頻率的變化，4組大鼠，每組8只，每15 min作為一個(gè)時(shí)間段，共8個(gè)時(shí)間段。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別以15 min共8個(gè)時(shí)間段記錄疼痛反應(yīng)和神經(jīng)元放電頻率變化。神經(jīng)元放電頻率以給藥前神經(jīng)元的放電頻率為參照, 計(jì)算給藥后反應(yīng)的相對(duì)值：給藥后實(shí)際反應(yīng)頻率/給藥前實(shí)際反應(yīng)頻率×100%。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析進(jìn)行比較，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 4種內(nèi)臟痛行為反應(yīng)[9]L:舔腹；B:伸腰；C:側(cè)扭；W:全身收縮Fig.1 Four kinds of formalin-induced painful behaviors[9]L: abdominal licking and nibbling; B: body stretching; C: contraction of the flanks; W: whole body contraction.

圖2 福爾馬林注射后各組不同時(shí)間段的疼痛分?jǐn)?shù)SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, 與 F 組相比較Fig. 2 The time course of pain scores after formalin injection(±SD)N: Formalin group; IT: Intrathecal group; NaCl:NaCl group; SP600125: SP600125 group. *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01, compared with group F.

結(jié) 果

1.福爾馬林復(fù)制內(nèi)臟炎癥痛模型的疼痛反應(yīng)

四個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射福爾馬林后30 min均達(dá)到疼痛評(píng)分的的最大值，并且在注射福爾馬林后45 min至120 min之間，疼痛評(píng)分逐漸降低。前60 min內(nèi)行為表現(xiàn)主要以W、C、B反應(yīng)為主；而在后60 min內(nèi)主要以L反應(yīng)為主（見(jiàn)圖1）。

2. JNK抑制劑SP600125減輕內(nèi)臟炎癥痛反應(yīng)

F、IT、NaCl組和SP600125組大鼠在注射福爾馬林后30 min均達(dá)到疼痛評(píng)分的最大值，從注射福爾馬林后45 min至120 min內(nèi)，疼痛評(píng)分逐漸降低，120 min時(shí)疼痛評(píng)分將至致痛前水平。SP600125組在前90 min內(nèi)疼痛分?jǐn)?shù)顯著低于F組（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01），IT組和NaCl組與F組相比較均未見(jiàn)顯著性差異（見(jiàn)圖2）。

3. 福爾馬林直腸黏膜下注射后神經(jīng)元放電頻率的變化

注射福爾馬林后，F(xiàn)組神經(jīng)元放電頻率立即明顯增加，致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min內(nèi)的放電頻率分別為致炎前基線水平的 252.36 ± 28.76%、288.74 ± 40.64% 和 186.47 ±32.16%，在30 min時(shí)達(dá)放電頻率最大值，與致炎前相比均有顯著性增加（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）, 提示福爾馬林注射后出現(xiàn)疼痛敏感化。在注射福爾馬林后45 min至120 min之間，放電頻率逐漸降低，各時(shí)間段與致炎前相比雖有增加，但無(wú)顯著性意義（見(jiàn)圖3）。

4. JNK抑制劑SP600125降低大鼠背角神經(jīng)元放電頻率

經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔插管給予JNK抑制劑SP600125 30 min后，福爾馬林直腸黏膜下注射致炎后神經(jīng)元放電仍有增加，SP600125組在致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min兩時(shí)間段的脊髓背角神經(jīng)元放電頻率分別為基線水平的146.86% ± 25.79%、175.49% ± 28.74%和126.48% ± 21.68%，與F組致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min內(nèi)的放電頻率 (252.36±28.76%、288.74±40.64%和186.47±32.16%) 分別相比均有顯著性的降低（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）； IT組和NaCl組與F組相比沒(méi)有顯著性差異（見(jiàn)圖4）。

圖3 福爾馬林直腸黏膜下注射后神經(jīng)元放電頻率的變化*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, 與注射前相比較Fig.3 Changes of the firing rate after formalin injection*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Before injection.

討 論

內(nèi)臟痛以性質(zhì)模糊、定位不明確、多通路傳導(dǎo)、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)異常和牽涉痛為特點(diǎn)，嚴(yán)重影響病人生活、工作、學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能等[10,11]。內(nèi)臟痛發(fā)病機(jī)制尚不明確，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于軀體痛研究，嚴(yán)重影響了內(nèi)臟痛病人的治療與預(yù)后[12,13]。痛覺(jué)敏感化將是內(nèi)臟炎癥痛新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)方向，針對(duì)多個(gè)信號(hào)通路聯(lián)合藥物鎮(zhèn)痛治療優(yōu)于單一藥物，聯(lián)合治療是內(nèi)臟痛治療原則[1,4]。我們既往研究表明，眾多信號(hào)分子，如PKC、ERK1/2參與內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制，在內(nèi)臟炎癥痛覺(jué)敏感化形成和維持中起重要作用，均可以作為內(nèi)臟炎癥痛治療新的藥物靶點(diǎn)[7～9]。JNK作為MAPKs信號(hào)通路中的一員，在痛覺(jué)信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，缺少在內(nèi)臟炎癥痛中作用的細(xì)致研究，目前眾多研究表明，PKC信號(hào)通路可以通過(guò)下游JNK信號(hào)通路，在神經(jīng)元可塑、細(xì)胞凋亡等病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用[14～16]。所以本研究觀察JNK抑制劑對(duì)內(nèi)臟炎癥痛覺(jué)敏感化的影響，研究JNK抑制劑對(duì)內(nèi)臟炎癥痛的治療作用，對(duì)探索聯(lián)合信號(hào)靶點(diǎn)（如PKC、JNK等）治療內(nèi)臟炎癥痛具有探索意義，也符合聯(lián)合治療內(nèi)臟痛的藥物治療原則。

MAPKs通路包括MAPKERK通路、MAPKJNK通路、MAPKP38通路和MKK5/MAPKERK5 4條通路[7]，Kondo T等、Sakurai J等分別利用胃擴(kuò)張內(nèi)臟痛模型，研究發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元內(nèi)P38、ERK激活，參與內(nèi)臟痛形成與維持的痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程[17,18]；與ERK、P38激活通路相比，JNK在病理性痛覺(jué)敏感化中研究相對(duì)較少，在內(nèi)臟痛痛覺(jué)敏感化調(diào)制中的作用研究更少[7]。Hao等利用軀體痛模型觀察到，大鼠腳掌注射蜂毒素后產(chǎn)生痛覺(jué)感受和痛覺(jué)過(guò)敏，在注射前、后腳掌炎癥局部給予 JNK抑制劑SP600125均可明顯抑制蜂毒素引起的外周自發(fā)痛覺(jué)感受和熱痛敏，但對(duì)機(jī)械痛敏效果較差，得出JNK可能對(duì)致炎后疼痛的維持和熱痛敏的產(chǎn)生起重要作用，且外周的熱痛敏和機(jī)械痛敏具有不同機(jī)制。同樣Obata等在 L5脊神經(jīng)結(jié)扎 (SNL)神經(jīng)病理性痛模型中，鞘內(nèi)注射 JNK 抑制劑 SP600125后，減輕 SNL引起的機(jī)械痛敏。我們應(yīng)用內(nèi)臟炎癥痛模型研究發(fā)現(xiàn)，福爾馬林直腸粘膜下致炎后，30 min時(shí)疼痛評(píng)分達(dá)最大值，同時(shí)脊髓背角神經(jīng)元放電達(dá)高峰，說(shuō)明30 min達(dá)到痛覺(jué)敏感化的高峰，給予JNK抑制劑SP600125后，能明顯減少疼痛評(píng)分，抑制脊髓背角神經(jīng)元放電，說(shuō)明JNK抑制劑SP600125減輕內(nèi)臟炎癥痛反應(yīng)，抑制內(nèi)臟炎癥痛覺(jué)敏感化，對(duì)內(nèi)臟炎癥痛具有鎮(zhèn)痛作用。JNK作為一種應(yīng)激激活的蛋白激酶，JNK被痛覺(jué)信號(hào)激活后，可通過(guò)一系列下游轉(zhuǎn)錄因子途徑發(fā)揮作用：如Jun家族(c- Jun、JunB、JunD)、E lk-1、p53、ATF- 2、JDP2、c- M yc、STAT、NFAT 和 Pax家族等，在炎癥反應(yīng)和神經(jīng)病理性損傷致痛覺(jué)敏感化中起重要作用[7]。JNK分為JNK1、JNK2和JNK3三種亞型，所以完善JNK（JNK1、JNK2和JNK3）那種亞型參與內(nèi)臟炎癥痛痛覺(jué)敏感化調(diào)制，同時(shí)探索PKC-JNK作為一條信號(hào)通路在內(nèi)臟炎癥發(fā)病機(jī)制中的作用，以及聯(lián)合抑制PKC、JNK治療內(nèi)臟炎癥痛，將是我們下一步研究的方向。

綜上所述，JNK抑制劑SP600125通過(guò)降低內(nèi)臟炎癥痛疼痛評(píng)分和抑制脊髓背角神經(jīng)元放電，起到抑制內(nèi)臟炎癥痛痛覺(jué)敏感化作用，JNK可能為內(nèi)臟炎癥痛鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)之一。

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