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狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患疾病(由動(dòng)物傳播到人類的疾病)?？袢《靖腥炯倚蠛鸵吧鷦?dòng)物，發(fā)病的動(dòng)物通過咬傷或抓傷，將唾液中的病毒傳播至人。除南極洲外，其他各洲都存在狂犬病，但95%以上的人類死亡病例發(fā)生在亞洲和非洲。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家以野生動(dòng)物狂犬病為主。近30年來我國(guó)狂犬病例發(fā)病數(shù)最低的一年是1996年(159例)，此后逐年上升至2007年的3 300例，而后逐年下降，2015年病例數(shù)為801例[1]。我國(guó)計(jì)劃于2025年消滅人狂犬病。目前，主動(dòng)與被動(dòng)免疫接種仍是控制狂犬病的最有效手段，本文就兩類免疫制劑的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 狂犬病毒簡(jiǎn)介和狂犬病主動(dòng)被動(dòng)預(yù)防措施

狂犬病毒(Rabies virus, RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對(duì)稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈RNA。

狂犬病毒含有5種主要蛋白(L、N、G、P和M)，L蛋白(Large protein)具有轉(zhuǎn)錄作用；N蛋白(Nucleoprotein)是核衣殼蛋白，為組成病毒粒子的主要核蛋白，其包裹著狂犬病毒的RNA基因組；P蛋白(Phosphoprotein)和病毒復(fù)制、包裝及逃逸機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)；G蛋白(Glycoprotein)是構(gòu)成病毒表面刺突的糖蛋白，是狂犬病病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在狂犬病毒致病與免疫中起著關(guān)鍵作用；M(Matrix protein)蛋白是病毒的基質(zhì)蛋白。

圖1 狂犬病毒基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of rabies virus

狂犬病毒暴露前可以預(yù)防性接種狂犬病疫苗，通過主動(dòng)免疫機(jī)制刺激機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒抗體?？袢《颈┞兜燃?jí)根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO) 動(dòng)物接觸分類標(biāo)準(zhǔn)可分為：Ⅰ類接觸(觸摸或飼養(yǎng)動(dòng)物，或被動(dòng)物舔舐完整的皮膚)，Ⅱ類接觸(造成輕微破損或無出血的輕微擦傷皮膚)，Ⅲ類接觸(穿透性的皮膚咬傷或抓傷，或粘膜污染)。

疑似狂犬病動(dòng)物抓傷或咬傷(Ⅱ類和Ⅲ類接觸)后的正確處理為：肥皂水徹底清洗傷口并及時(shí)注射狂犬病疫苗(Ⅱ類接觸)或同時(shí)注射狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白(Ⅲ類接觸)。

2 人用狂犬病疫苗現(xiàn)狀和研發(fā)進(jìn)展

狂犬病疫苗免疫后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒中和抗體，激活T淋巴輔助細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞，保護(hù)動(dòng)物免受病毒感染。我國(guó)每年接種1200-1500萬劑次的狂犬病疫苗，為全世界接種狂犬病疫苗最多的國(guó)家。最早期的狂犬病疫苗是在動(dòng)物的神經(jīng)組織中生產(chǎn)，采用的是干燥法滅活病毒法。后來的Semple疫苗采用化學(xué)滅活法(酚滅活)，需要連續(xù)接種14-21針[2]。雖然價(jià)格相對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的疫苗便宜，但接種次數(shù)太多且副作用大，WHO不推薦使用，我國(guó)已于1991年開始禁用神經(jīng)組織疫苗。1955年左右開始由鳥類動(dòng)物胚胎生產(chǎn)狂犬病疫苗(如鴨胚胎)。通過多輪的密度梯度離心去除非病毒脂質(zhì)成分，并以β丙內(nèi)酯滅活病毒。1967年開發(fā)了人類二倍體細(xì)胞(The human diploid cell vaccine, HDCV)。1970年代末開始又逐步開發(fā)了不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗，如地鼠腎細(xì)胞、狗腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞和Vero細(xì)胞等[3]。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的疫苗主要來源于Vero細(xì)胞培養(yǎng)，其次為人二倍體細(xì)胞和地鼠腎細(xì)胞。

細(xì)胞中生產(chǎn)病毒的成本高，生產(chǎn)過程中有風(fēng)險(xiǎn)，貯存和運(yùn)輸需要低溫。目前的狂犬病疫苗接種次數(shù)仍然偏多，尤其是對(duì)于暴露后的接種，需要盡可能少的接種次數(shù)且能充分誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生足量保護(hù)性抗體。基于減少狂犬病疫苗接種次數(shù)，價(jià)格及提高疫苗接種普及率和接種者依從性等方面的考慮，目前仍然有必要研發(fā)更為廉價(jià)、免疫原性更強(qiáng)和注射次數(shù)少的下一代狂犬病疫苗。

天然G蛋白在狂犬病毒包膜上為三聚體結(jié)構(gòu)。G蛋白需要胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)同時(shí)表達(dá)方能形成具有正確空間結(jié)構(gòu)的三聚體。正確折疊和糖基化修飾后，G蛋白具有充分的免疫原性，可誘發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。G蛋白也可以在感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上。有效的抗體不但可以中和并清除狂犬病毒，其還可以通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)清除被感染的細(xì)胞[4-5]。因此以G蛋白為抗原的疫苗是下一代疫苗研發(fā)的方向。但膜蛋白純化困難，純化過程中很難保持正確空間結(jié)構(gòu)，一旦空間結(jié)構(gòu)破壞即失去部分空間表位，免疫原性降低。

包括一個(gè)跨膜區(qū)，一個(gè)胞外區(qū)，一個(gè)胞內(nèi)區(qū)，其中五個(gè)免疫原性區(qū)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和a)位于胞外區(qū)。圖2 狂犬病毒G蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structure of rabies virus glycoprotein (G protein)

以下幾種系統(tǒng)曾經(jīng)被嘗試用于表達(dá)和純化G蛋白。

2.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)成熟且重組蛋白產(chǎn)量高，但表達(dá)的G蛋白非可溶性，沒有翻譯后修飾如糖基化修飾。因此G蛋白不能正確折疊形成正確的空間結(jié)構(gòu)，蛋白免疫原性差，不能作為抗原激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)度中和抗體[6]。

2.2直接從培養(yǎng)的狂犬病毒中純化 狂犬病毒培養(yǎng)生產(chǎn)工藝繁瑣，對(duì)生物安全要求高，相對(duì)于減毒疫苗和滅活疫苗多了一步G蛋白純化步驟，大幅增加成本。盡管純化的G蛋白具有較好的免疫原性，但因?yàn)槌杀具^高而沒有推廣應(yīng)用價(jià)值[7-8]。

2.3昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞Sf9表達(dá)的G蛋白會(huì)被分泌到細(xì)胞膜上，一般會(huì)形成正確的三維結(jié)構(gòu)并具有類似的生物學(xué)活性。可能由于翻譯后修飾機(jī)制不同，Sf9細(xì)胞表達(dá)的G蛋白分子量較哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的小。通過將表達(dá)G蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物作為免疫原免疫小鼠，可以產(chǎn)生中和抗體。但G蛋白純化提取工作繁瑣，成本高，限制了其推廣應(yīng)用[9-11]。黑腹果蠅S2細(xì)胞也被用來作為宿主細(xì)胞表達(dá)G蛋白，表達(dá)G蛋白的S2細(xì)胞裂解物免疫小鼠可以誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體[12]。有學(xué)者應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)S2細(xì)胞來表達(dá)G蛋白，并就生物反應(yīng)器的S2細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行了多方面優(yōu)化，但依然面臨免G蛋白的提取純化問題，期待后續(xù)能夠在蛋白提取工藝上有所突破[13-15]。

2.4酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 酵母細(xì)胞是一種經(jīng)濟(jì)高效的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可以成功實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)，成本低廉，培養(yǎng)條件要求不高，適宜工業(yè)放大。盡管酵母系統(tǒng)有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但表達(dá)的G蛋白不能正確折疊，并有可能形成異常多聚體，此外酵母的高甘露糖糖基化修飾不利于G蛋白的穩(wěn)定并對(duì)蛋白免疫原性有影響，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示酵母細(xì)胞表達(dá)的G蛋白能夠在被免疫的小鼠中產(chǎn)生中和抗體，但僅僅能保護(hù)肌肉內(nèi)注射的毒株攻擊，不能保護(hù)大腦內(nèi)注射的毒株攻擊[16-17]。基于以上原因，酵母不適合作為G蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

2.5轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 在植物如西紅柿中、煙葉和玉米中表達(dá)抗原蛋白具有生產(chǎn)成本低、物流成本低、給藥方便等優(yōu)勢(shì)。植物中的G蛋白可經(jīng)過進(jìn)食在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。植物表達(dá)系統(tǒng)的以下缺點(diǎn)限制了其大規(guī)模推廣應(yīng)用： 1)劑量不好衡量，尤其是對(duì)于暴露后的免疫； 2)烹飪方式差異、進(jìn)食咀嚼方式差異、消化道微環(huán)境和pH值差異影響了抗原蛋白的降解和接觸免疫系統(tǒng)的機(jī)會(huì)； 3)該類型抗原蛋白在人體中是否能夠引起有效的免疫反應(yīng)尚無實(shí)驗(yàn)結(jié)論[18-20]。

2.6哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的G蛋白具有正確的翻譯后修飾和折疊，免疫原性好。但G蛋白提取時(shí)常用的去污劑是Triton X-100，這會(huì)造成G蛋白變性。從細(xì)胞膜上提取G蛋白比從病毒中提取過程要繁瑣許多。此外，和可溶性蛋白相比較，膜蛋白的產(chǎn)量低。有報(bào)道稱在MDBK細(xì)胞中表達(dá)了可溶性的G蛋白的胞外區(qū)，但因?yàn)闆]有跨膜區(qū)域協(xié)助蛋白正確折疊，所表達(dá)的蛋白免疫原性弱，其表達(dá)的可溶性蛋白僅可用于診斷研究[21]。

懸浮培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)可達(dá)到很高的細(xì)胞密度(1-3×107/mL)，培養(yǎng)體系可達(dá)到2 000-10 000 L，蛋白產(chǎn)量高，且翻譯后修飾如糖基化類似于人體細(xì)胞，蛋白活性好，被廣泛用于表達(dá)各種治療性蛋白如單克隆抗體等。有研究采用CHO表達(dá)了可溶性的G蛋白胞外區(qū)，但僅表達(dá)可溶性的胞外區(qū)不能形成有強(qiáng)免疫原性的三聚體結(jié)構(gòu)[22]。CHO細(xì)胞表達(dá)G蛋白目前主要用于G蛋白糖基化研究[23-26]。

除了利用上述不同系統(tǒng)表達(dá)和純化G蛋白外，將G蛋白基因?qū)虢臃N者體內(nèi)使其在接種者體內(nèi)表達(dá)G蛋白也是狂犬疫苗的一個(gè)發(fā)展方向。

2.7核酸疫苗

2.7.1DNA疫苗 將含有G蛋白基因的質(zhì)粒DNA通過鼻腔灌注、肌肉注射、皮下注射及基因槍等途徑導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)的G蛋白可在兔子、貓、狗、小鼠和獼猴體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生中和抗體[27-30]。

2.7.2RNA疫苗 用含有狂犬病毒G蛋白基因的RNA作為疫苗免疫小鼠，小鼠產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)類似于DNA疫苗[31]。

雖然核酸疫苗具有生產(chǎn)成本低、易于運(yùn)輸和保存等優(yōu)點(diǎn)，但有整合入接種者基因組的風(fēng)險(xiǎn)(DNA疫苗)及產(chǎn)生免疫反應(yīng)所需時(shí)間長(zhǎng)、免疫反應(yīng)較弱等缺點(diǎn)，不能用于狂犬病毒暴露后免疫，暴露前預(yù)防性接種的優(yōu)勢(shì)也不大，以上諸多原因限制了其應(yīng)用。

2.8利用病毒載體在被免疫動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)G蛋白 利用病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)G蛋白以激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫是具有前景的方法[32]。病毒載體疫苗已在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家野生動(dòng)物狂犬病控制中得到廣泛應(yīng)用且效果顯著。病毒載體基因組中含有G蛋白基因，可在接種者體內(nèi)表達(dá)G蛋白，但病毒載體疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是：接種者體內(nèi)如業(yè)已存在抗病毒載體抗體會(huì)抑制病毒載體的感染復(fù)制和G蛋白抗原的表達(dá)。

2.8.1痘病毒載體(Poxvirus)疫苗 痘苗病毒(Vaccinia)是痘病毒的一種。減毒痘病毒狂犬病疫苗已經(jīng)被歐洲和美國(guó)用于免疫動(dòng)物如紅狐貍、浣熊、郊狼、臭鼬等，有效地降低了狂犬病在上述野生動(dòng)物中的發(fā)病率。減毒的痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus Ankara, MVA)在大部分細(xì)胞中不能復(fù)制，人體對(duì)其免疫耐受性好于普通痘苗病毒。但以MVA為載體的G蛋白疫苗在小鼠中的免疫原性不及普通痘苗病毒疫苗強(qiáng)[33]。痘苗病毒載體疫苗因?yàn)椴荒芡耆珳p毒且在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫方面的能力較弱因而人群中應(yīng)用的前景不大。

2.8.2腺病毒(Adenovirus, Ad)載體疫苗 腺病毒能感染人的呼吸道、消化道、尿道、膀胱和眼等組織和器官，其基因不能整合入人體基因組，沒有潛在的致癌能力，安全性也已經(jīng)得到認(rèn)證[34-35]。

其中人腺病毒5型(Adenovirus human serotype 5, AdHu5)載體疫苗使用的AdHu5刪除了E1基因，是一種復(fù)制缺陷型病毒。AdHu5誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于痘苗病毒和DNA病毒。因病毒不能復(fù)制，減少了其在免疫缺陷人群中應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。但因普通人群AdHu5抗體陽性率較高，限制了其應(yīng)用[36-37]。

采用黑猩猩腺病毒(Adenovirus Chimpanzee-Derived Serotypes, AdC)載體構(gòu)建的疫苗因人群中普遍不含抗AdC抗體，表達(dá)G蛋白的AdC在經(jīng)肌肉注射、口腔或鼻腔免疫小鼠一次后可產(chǎn)生持久保護(hù)性抗體[38-39]。目前，基于AdC3的Ebola疫苗已經(jīng)完成一期臨床試驗(yàn)，受試者肌肉注射疫苗一次，耐受性良好且產(chǎn)生的抗體可以持續(xù)到接種后48周，二期臨床試驗(yàn)在進(jìn)行中[40-41]。鑒于Ebola AdC病毒疫苗的臨床研究結(jié)果，狂犬病AdC疫苗前景樂觀。

綜上所述，G蛋白提取困難導(dǎo)致其成本居高不下，G蛋白亞單位疫苗目前不具備大規(guī)模推廣應(yīng)用條件。病毒載體疫苗尤其腺病毒載體安全、有效、經(jīng)濟(jì)、使用方便，是下一代人狂犬病疫苗的發(fā)展方向。

3 狂犬病被動(dòng)免疫制劑現(xiàn)狀和研發(fā)進(jìn)展

3.1狂犬病免疫球蛋白 狂犬病疫苗注射到產(chǎn)生有效抗體需要14 d左右時(shí)間，在產(chǎn)生有效抗體前的約2周的窗口期需要狂犬病被動(dòng)免疫制劑如狂犬病免疫球蛋白來中和傷口附近可能存在的狂犬病毒?？袢∶庖咔虻鞍鬃⑸浜竽軌蛄⒓粗泻蛡诰植康拇蟛糠植《荆柚共《緮U(kuò)散并侵入神經(jīng)系統(tǒng)?？袢∶庖咔虻鞍椎陌胨テ跒?4～21 d，可為疫苗誘發(fā)主動(dòng)免疫贏得時(shí)間。狂犬病被動(dòng)免疫制劑和疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可以最大限度地預(yù)防狂犬病發(fā)生。

目前市場(chǎng)上的狂犬病免疫球蛋白有兩種。

3.1.1馬源狂犬病免疫球蛋白(Equine rabies immunoglobulin, ERIG) 狂犬病毒免疫馬匹采集血漿，經(jīng)胃酶消化后，用硫酸胺鹽析法制得的液體或凍干的免疫球蛋白制劑。因?qū)儆诋愒葱缘鞍?，注射后過敏反應(yīng)多見，程度輕重不一，嚴(yán)重者可致人死亡。

3.1.2人源狂犬病免疫球蛋白(Human rabies immunoglobulin, HRIG) 先用乙型肝炎疫苗免疫健康人后再經(jīng)人用狂犬病疫苗免疫獲得血漿，經(jīng)提取、滅活病毒制成人抗狂犬病毒免疫球蛋白。缺點(diǎn)是來源有限，價(jià)格昂貴。一般無不良反應(yīng)，少數(shù)人有紅腫、疼痛感，無需特殊處理，可自行恢復(fù)。

ERIG和HRIG供應(yīng)量有限，價(jià)格偏高，在狂犬病呈地方性流行的不發(fā)達(dá)地區(qū)難以普及。且疫苗聯(lián)合HRIG或ERIG應(yīng)用并不能保護(hù)所有狂犬病毒屬血清型的感染[42-43]。

3.2狂犬病毒單克隆中和抗體(monoclonal antibody, mAb) 特異性的單克隆抗體相較于狂犬病免疫球蛋白，具有安全性好，特異性強(qiáng)，用量小，成本低，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。效果與HRIG近似，適用于暴露后治療，臨床應(yīng)用前景廣闊。 一個(gè)單克隆抗體只能識(shí)別一個(gè)抗原表位，因此一般將數(shù)個(gè)單克隆抗體混合使用[44]。WHO推薦開發(fā)抗狂犬病G蛋白的單克隆抗體并且使用多個(gè)抗體的混合制劑以替代現(xiàn)有的HRIG或ERIG[45]。

國(guó)內(nèi)外目前處于開發(fā)階段的抗狂犬病毒單克隆抗體有：

3.2.1MassBiologics和印度血清研究所(Serum of Institute of India)共同開發(fā)的RAB1(I7C7)，該單克隆抗體的表達(dá)細(xì)胞是CHO，結(jié)合的抗原表位在胞外區(qū)免疫原性區(qū)域III[46-47]。該單抗雖不能結(jié)合狂犬病毒所有血清型的G蛋白[48]，但對(duì)絕大多數(shù)已知的狂犬病毒血清型中和效果良好，目前印度正在進(jìn)行二期與三期臨床試驗(yàn)。

3.2.2Crucell Holland BV開發(fā)的CL184(CR57和CR4098兩個(gè)單抗的混合制劑，兩個(gè)單抗結(jié)合表位分別位于免疫原性區(qū)域I和III)，表達(dá)細(xì)胞為Per.C6。雖然兩種抗體聯(lián)合使用可以結(jié)合絕大部分狂犬病毒株，但因抗體不能結(jié)合中和所有狂犬病毒毒株而暫時(shí)終止二期臨床試驗(yàn)[49-51]?？紤]到不同區(qū)域狂犬病毒流行株的差異，該單克隆抗體混合制劑依然有巨大的開發(fā)價(jià)值。

3.2.3RVC20和RVC58(分別結(jié)合位于免疫原性區(qū)域I和III的表位)為新報(bào)道的抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體，表達(dá)細(xì)胞為Per.C6，可以中和所有35種狂犬病毒，效果優(yōu)于CR57，CR4098和RAB1，目前處于臨床研究前期[52]。

3.2.4SYN023(CTB011和CTB012兩個(gè)單抗的混合制劑)是另一組新報(bào)道的人源化抗狂犬病毒G蛋白單抗混合物，和HRIG在動(dòng)物中的保護(hù)效果相當(dāng)。表達(dá)細(xì)胞為CHO-DG44，動(dòng)物試驗(yàn)中接種劑量0.03 mg/kg即可達(dá)到保護(hù)效果。CTB011結(jié)合表位為免疫原性區(qū)域III和其附近區(qū)域，CTB011結(jié)合表位為多個(gè)不連續(xù)的保守的氨基酸形成的空間表位，不屬于已經(jīng)報(bào)道的G蛋白免疫原性區(qū)域。初步研究表明SYN023可以中和中國(guó)流行的15株狂犬病毒毒株和北美地區(qū)流行的12株狂犬病毒株，目前處于臨床研究前期[53]。

3.2.5我國(guó)目前在人源抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體(mAb)的研究已處于世界前列。國(guó)內(nèi)多家學(xué)術(shù)科研機(jī)構(gòu)報(bào)道了抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及中和作用效果[54-56]。其中，華北制藥集團(tuán)從2003年開始進(jìn)行人源化抗狂犬病毒單克隆抗體(NM57)的研發(fā)工作，已得到了高水平表達(dá)工程細(xì)胞株，對(duì)制備得到的HuMAbs純品進(jìn)行了充分鑒定，用狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株(CVS)以及中國(guó)有代表性的街毒株進(jìn)行了中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示NM57對(duì)狂犬病毒有明確的中和作用。同時(shí)，在街毒株的攻擊實(shí)驗(yàn)中，顯示了優(yōu)于市售HRIG的保護(hù)率[57-58]。NM57為CHO細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體，與Crucell Holland BV開發(fā)的CR57(表達(dá)系統(tǒng)為Per.C6細(xì)胞)一樣源于單克隆抗體SO57株(表達(dá)系統(tǒng)為BSR細(xì)胞)，NM57的中和靶位為狂犬病毒G蛋白高度保守的免疫原性區(qū)域I[58-60], NM57已于2013年完成一期臨床試驗(yàn)，安全性良好[61]。2016年底已完成二期臨床試驗(yàn)，抗體特異性好，注射所需量約為1mg/人份，用量約為血源抗狂犬病免疫球蛋白的千分之一，預(yù)計(jì)可以顯著壓縮價(jià)格至傳統(tǒng)HRIG的1/3。雖然其不能保護(hù)所有的狂犬病毒株感染，但針對(duì)中國(guó)的狂犬病毒流行株，是可以起到有效保護(hù)作用的。該單克隆抗體的上市后必定會(huì)對(duì)我國(guó)狂犬病防治產(chǎn)生重大正面促進(jìn)作用。

4 結(jié) 語

發(fā)達(dá)國(guó)家已基本消除人和家養(yǎng)寵物的狂犬病，將狂犬病預(yù)防重心轉(zhuǎn)移到野生動(dòng)物上，并取得了顯著成果。盡管現(xiàn)有的狂犬病毒滅活疫苗需要暴露前注射3針，暴露后需要注射4～5針，但在發(fā)達(dá)國(guó)家狂犬病極其罕見，市場(chǎng)需求少，疫苗公司缺乏動(dòng)力研發(fā)新型疫苗。對(duì)于經(jīng)濟(jì)落后國(guó)家，更為簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的疫苗仍存在很大需求。

對(duì)于暴露前的大規(guī)模預(yù)防接種尤其需要這種疫苗具有絕對(duì)的安全性、經(jīng)濟(jì)性以及免疫的持久性，腺病毒載體疫苗尤其是黑猩猩腺病毒載體疫苗可以滿足這方面的要求。對(duì)于暴露后接種，需要疫苗能夠在盡量短的時(shí)間內(nèi)誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。這種情況下DNA疫苗因?yàn)檎T導(dǎo)免疫反應(yīng)所需時(shí)間長(zhǎng)，不是好的選擇?？梢赃x擇已有的滅活病毒疫苗或病毒載體疫苗結(jié)合狂犬病毒免疫球蛋白或單克隆中和抗體。相信隨著研發(fā)的進(jìn)展，基于狂犬病毒G蛋白的更為廉價(jià)方便的疫苗會(huì)在不久的將來會(huì)問世。

對(duì)于可能替代狂犬病毒抗血清的單克隆抗體，雖然其對(duì)生產(chǎn)技術(shù)要求高，但其優(yōu)點(diǎn)不言而喻，可大規(guī)模生產(chǎn)降低成本，批次間效價(jià)的差異小，可以做成干粉，方便運(yùn)輸和貯存，提高保存期且更容易在偏遠(yuǎn)地區(qū)運(yùn)用?？袢《究寡宀荒芴峁?00%的保護(hù)，狂犬病毒單克隆抗體也存在同樣問題。目前在研的單克隆抗體，其結(jié)合的表位均位于相對(duì)保守的區(qū)域。單個(gè)抗體不能中和所有毒株，會(huì)有免疫逃逸株出現(xiàn)[49-51]。WHO推薦使用混合制劑，將兩種或兩種以上識(shí)別不同表位的抗體聯(lián)合使用?；旌现苿┚哂幸韵绿攸c(diǎn)：高效價(jià)，識(shí)別G蛋白上不同的無重合區(qū)域的表位，能中和盡可能多的毒株，可以顯著減少或消除免疫逃逸毒株。

對(duì)于在中國(guó)和印度進(jìn)行臨床試驗(yàn)的單個(gè)單克隆抗體制劑，無疑存在免疫逃逸株的問題，但考慮到中印兩國(guó)狂犬病毒流行株的流行情況，其使用是可以達(dá)到中和當(dāng)?shù)亓餍械亩局昴康?。單一抗體制劑的生產(chǎn)工藝和成本較兩種或兩種以上抗體混合制劑要低。相對(duì)于HRIG或ERIG的昂貴及短缺，其在中印這兩個(gè)狂犬病高發(fā)國(guó)家控制和減低暴露后風(fēng)險(xiǎn)還是有意義的。當(dāng)然以后的發(fā)展方向還是混合制劑。

隨著時(shí)間的推進(jìn)仍有可能會(huì)產(chǎn)生由基因突變和基因交換而來的新免疫逃逸株。就此問題需要結(jié)合狂犬病毒流行株分子流行病學(xué)上的監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)，針對(duì)狂犬病毒流行株的變異情況，不斷更新單克隆抗體混合制劑，提高抗體的保護(hù)范圍，減少免疫逃逸株的出現(xiàn)。

隨著新一代狂犬病疫苗以及狂犬病毒單克隆抗體的研發(fā)和應(yīng)用，有信心期待2025在中國(guó)消滅人狂犬病，進(jìn)而消滅家養(yǎng)寵物狂犬病并有效控制野生食肉動(dòng)物狂犬病。

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