蔣海港 王樹剛 劉 陽 沈彥合 李祥寧 曹 穎

(西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010)

木質(zhì)素(lignin)是一種復雜的酚類高分子化合物，其生物合成主要是通過苯丙酮酸途徑(phenylpropanoid pathway)和木質(zhì)素特異合成途徑[1]。苯丙酮酸途徑上的苯丙氨酸氨裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸4-羥基化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、香豆酸3-羥化酶(C3H)、和4-香豆酸CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)，它們表達活性的高低與木質(zhì)素總量密切相關；而木質(zhì)素特異合成途徑上的咖啡酸O-甲基轉移酶(Caffeic acid O-methyltransferase,COMT)、咖啡酰CoA-O-甲基轉移酶(Caffeoyl-CoA-O-methyltransferase,CCoAOMT)和阿魏酸-5-羥基化酶(Ferulate 5-hydroxylase,F5H)，與木質(zhì)素單體特異合成相關，它們的表達對木質(zhì)素含量尤其木質(zhì)素單體的特異合成影響較大，決定了各種單體在木質(zhì)素總量中的比例。羥基肉桂酸脫氫酶(Cinnamoyl alcohol dehydrogenase,CAD)和肉桂酰-CoA還原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是位于木質(zhì)素特異合成途徑下游的還原酶，它們負責將各種羥基肉桂酰-輔酶A(CoA)酯還原成各種木質(zhì)素單體，對木質(zhì)素的合成與代謝也起關鍵作用[2]。另外，木質(zhì)素單體的聚合過程還需要過氧化物酶(Peroxidase)和漆酶(Laccase,LAC)的催化，但在木質(zhì)素聚合過程中的具體功能至今還不清楚[3]。

盡管木質(zhì)素是植物生長發(fā)育所必須的，但由于木質(zhì)素和纖維素高度膠聯(lián)，木質(zhì)素成為生物質(zhì)能源利用如造紙和生物乙醇生產(chǎn)的主要障礙[4～6]。竹類植物纖維素含量較高，一般在40%～60%，竹漿的性能在針葉林和闊葉林之間，優(yōu)于草漿類，是優(yōu)良的造紙用纖維原料[7]。但是，竹類木質(zhì)素含量比其他草本植物要高，研究竹類木質(zhì)素生物合成途徑，尋找其關鍵基因，遺傳調(diào)控竹類植物的木質(zhì)素合成，培育高纖維素、低木質(zhì)素的竹材，對造紙行業(yè)及生物乙醇生產(chǎn)具有重大意義。近年來竹類植物的分子生物學研究取得了一定的進展。毛竹(Moso bamboo,Phyllostachysheterocycla)基因組草圖的發(fā)布[8]，以及毛竹、麻竹(Ma bamboo,DendrocalamuslatiflorusMunro)、巨龍竹(Da bamboo,Dendrocalamussinicus)等竹種的轉錄組和(或)蛋白組研究，為從分子水平揭示竹類植物高速生長和開花機制，以及細胞壁發(fā)育與調(diào)控機制奠定了基礎[9～12]。慈竹(Bambusaemeiensis)，是四川本土大型叢生竹之一，其稈徑較小且稈壁薄，纖維含量和長度優(yōu)良，是較好的造紙原料[13～14]。但與毛竹、麻竹等竹種相比，慈竹分子生物學研究相對滯后，其木質(zhì)素生物合成途徑和相關功能基因仍不清楚。

竹子為單子葉植物,沒有次生生長。竹筍伸長主要是由節(jié)部居間分生組織的活動所決定的；筍高度的增加是節(jié)間伸長的結果。隨著筍的伸長，筍各部分纖維素和木質(zhì)素含量逐漸積累[10]。竹筍的這種獨特的順序發(fā)育機制，使其成為研究竹子高生長特性，以及纖維素和木質(zhì)素生物合成機制的理想模型。近年來，竹類植物的基因組、轉錄組及蛋白質(zhì)組等研究也多以竹筍為對象進行的[10～12]。我們前期利用Illumina HiSeqTM2000平臺，對露出地面10、50、100和150 cm高的慈竹筍進行了轉錄組測序，獲得了早期伸長階段的慈竹筍轉錄組數(shù)據(jù)庫，分析了其中纖維素合成關鍵基因[15]，但尚未對木質(zhì)素合成途徑和相關基因表達進行深入分析。

本文根據(jù)慈竹筍RNA高通量測序結果，用擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)等植物的已知木質(zhì)素生物合成基因作為查詢序列，通過BLASTp分析，結合系統(tǒng)進化分析，在筍轉錄組數(shù)據(jù)庫中比對鑒定出了一系列與木質(zhì)素生物合成相關的基因。同時，對這些木質(zhì)素合成基因在不同發(fā)育階段筍中的差異表達進行了分析，探討了慈竹筍早期伸長過程中木質(zhì)素含量變化及其與分子表達的關系，預測到一些可能參與發(fā)育性木質(zhì)素積累的候選基因，為慈竹的分子遺傳育種以及品種改良等提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

慈竹材料采自西南科技大學(四川綿陽)資源圃(年平均氣溫17.2℃，年平均降雨量793.5 mm)。分別取立地條件一致的當年生的10，50，100和150 cm高度的筍，每個高度取3株獨立的筍(測量誤差小于2 cm)，取基部第二個節(jié)間組織切碎、混勻，液氮速凍后，儲存于-80℃冰箱中備用。

1.2 組織解剖和木質(zhì)素含量分析

筍組織樣品(0.5 cm3)取自不同高度慈竹筍基部第二個節(jié)間中部，經(jīng)FAA溶液固定后保存，常規(guī)的石蠟切片法進行組織切片，番紅固綠染色[16]。Leica LDM 2500顯微照相，用內(nèi)置的標尺進行顯微測量，數(shù)字圖像用用Image ProPlus software(IPP6.0,Media Cybernetics,Inc.)分析。木質(zhì)素含量的測定采用乙酰溴法[17]，每個樣品取3次生物學重復，并重復測定3次。

1.3 轉錄組數(shù)據(jù)分析

采用Plant RNA Kit(OMEGA BIO-TEK)分別提取露出地面10、50、100和150 cm高的慈竹筍總RNA，構建4個樣品的cDNA測序文庫。利用Illumina HiSeqTM2000平臺進行轉錄組測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去除雜質(zhì)和去冗余處理，以及序列拼接和聚類分析后，組裝獲得Unigene序列。以擬南芥、水稻等已知木質(zhì)素基因為查詢序列，通過BLASTp在慈竹筍Unigene數(shù)據(jù)庫中篩選假定的木質(zhì)素合成相關序列。根據(jù)其與擬南芥、水稻同源基因注釋命名基因。將獲得的序列經(jīng)DAMBE檢測飽和度[18]后導入MEGA7.0，用最大似然法(Maximum Likehood,ML)，選擇WAG+G+F模型構建系統(tǒng)進化樹。對生成的系統(tǒng)進化樹進行Bootstrap校正(參數(shù)設為500 replicates)，生成最終的系統(tǒng)進化樹。

1.4 基因差異表達和定量qRT-PCR分析

基于RNA高通量測序結果，統(tǒng)計考察基因的相對表達豐度(reads per kilo bases per million mapped reads,RPKM)。同時，將各樣品的RPKM值經(jīng)均一化處理后，以10cm筍的RPKM值為參照，以|log2 FC(Fold Change)|≥2(FDR<0.01)為標準，并運用MeV軟件做層次聚類分析，篩選差異表達基因。選擇一些差異表達基因，用SyBR Green PCR Master Mix(天根生物)和基因特異引物(表2)在iQ5熒光定量PCR系統(tǒng)(BIO-RAD)進行qRT-PCR分析。每個樣品被擴增3次。以慈竹Tublin基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[19]計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 早期伸長階段慈竹筍的木質(zhì)素含量和組織解剖結構

慈竹在發(fā)筍初期出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象。早期生長階段慈竹筍(10～150 cm高度)木質(zhì)素含量分析表明，隨著筍伸長，慈竹筍基部的木質(zhì)素含量逐漸增加(圖1A)。解剖結構分析表明，幼嫩的10 cm筍基部節(jié)間出現(xiàn)可辨識的導管組織，維管束結構基本形成。隨著筍的伸長，維管束中的纖維細胞的數(shù)量隨筍齡的增加而增加，發(fā)生木質(zhì)化。50 cm筍中初步出現(xiàn)了木質(zhì)化的纖維細胞，隨著筍高度的增加，木質(zhì)化程度加深(圖1B)。這與木質(zhì)素含量分析結果相一致。

圖1 早期伸長階段慈竹筍木質(zhì)素含量和解剖結構 A.不同高度筍木質(zhì)素含量；B.不同高度筍基部節(jié)間解剖分析 F.纖維細胞；LF.纖維素細胞木質(zhì)化；MX.后生木質(zhì)部；P.薄壁組織；PP.原生韌皮部；PX.原生木質(zhì)部Fig.1 Lignin content and anatomical analysis of B.emeiensis shoots during the early elongation stages A. Lignin content in developing bamboo shoots; B. Paraffin transverse and longitudinal sections of culms at the basal 2nd internode of different height shoots F. Fiber cells; LF. Lignification of fiber cells; MX. Metaxylem; P. Parenchyma cells; PP. Protophloem; PX. Protoxylem

2.2 慈竹筍中木質(zhì)素生物合成相關基因

BLASTp分析從慈竹筍轉錄組數(shù)據(jù)庫比對鑒定出351個與木質(zhì)素生物合成相關Unigenes(E-value<10-10)：其中與木質(zhì)素單體聚合相關的Peroxidase和LAC的轉錄子最為豐富，分別為155條和51條(表1)；與木質(zhì)素單體合成相關Unigenes，135個，其中尤以編碼4CL和CCR的序列最為豐富，分別為37條和34條，其次是PAL和CAD轉錄子，分別為26和25條，而參與甲基化過程的COMT和CCoAOMT和參與羥基化C3H、C4H和F5H蛋白，僅有少數(shù)轉錄子被檢測到(表1)。這與已報道的麻竹、毛竹、巨龍竹等其他的竹類植物是相似的[9,11～12]。

為避免注釋的錯誤，我們從BLASTp篩選到的135個木質(zhì)素單體合成相關Unigenes(序列)和51條LAC序列中，選取了59條可信度較高的Unigene序列(E value=0)，進行了系統(tǒng)進化分析。系統(tǒng)進化分析結果證明了BLAST比對和注釋結果的準確性。在59條Unigene序列中，僅有4個序列(2個CCR、1個LAC和1個F5H)沒有聚類到與注釋結果對應的進化簇分支中，這可能與這4個Unigene序列長度不足有關(<1 000 bp)(圖2)。

2.3 木質(zhì)素單體合成相關基因的差異表達

轉錄組數(shù)據(jù)分析表明，在4個不同高度慈竹筍中，控制木質(zhì)素生物合成碳流入口的苯丙酮酸途徑中的一些關鍵酶基因如PAL和4CL，以及一些參與特異木質(zhì)素單體合成的CCR和CAD基因呈現(xiàn)較高的相對表達豐度，其相對表達水平(RPKM值)在162～698范圍內(nèi)(圖3A)。在50、100和150 cm筍中，大部分基因的表達水平較為接近，但與較幼嫩10cm筍距離較遠(圖3A)。

基因的差異表達分析表明，隨著筍的伸長，木質(zhì)素合成途徑中4種關鍵酶的編碼基因，如PAL、4CL、CCR、CAD呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達。其中2條PAL1(CL56Contig1和CL56Contig4)，2條4CL3(CL1213Contig2和T3Unigene34303)和1個4CL4(CL1213Contig1)、5條CCR1(T3Unigene19278、T3Unigene31394、CL21423Contig1、T4Unigene31965和T1Unigene17952)和2條CADH2(CL25770Contig、CL17216Contig1)基因，其表達明顯上調(diào)(│log2 FC(Fold Change)│≥2，圖3B)，表明這些基因的表達可能與發(fā)育性木質(zhì)化進程相關。

表1慈竹、巨龍竹、麻竹和毛竹等竹類植物的木質(zhì)素合成基因數(shù)目

Table1NumberofligningenesfoundinB.emeiensisandotherbamboospeciesincludingDabamboo,MabambooandMosobamboo

酶Enzymes慈竹Bambusa emeiensisa巨龍竹Da bamboo[12]a麻竹Ma bamboo[9]a毛竹Moso bamboobPAL26151713C4H28411C3H36034CL3726356HCT122704CCR3447103CCoAOMT3942CAD251521F5H151313COMT2272DAHPS10672LAC51273416Peroxidase155174163143A1dOMT0002

注：木質(zhì)素合成相關基因的數(shù)據(jù)分別來自于轉錄組數(shù)據(jù)庫a和基因組數(shù)據(jù)庫(Bamboo Genome Database，http://www.bamboogdb.org/)b

Note：Number of lignin biosynthesis genes found in the bamboo transcriptomeaand bamboo genome( http://www.bamboogdb.org/)b,respectively.

圖2 慈竹木質(zhì)素生物合成基因系統(tǒng)進化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of lignin biosynthesis genes identified in shoots of B.emeiensis

圖3 不同生長高度的慈竹筍木質(zhì)素基因的相對表達(RPKM值)和差異表達(log2值)Fig.3 The relative expression(RPKM value,A) and the differential expression(log2 value,B) of lignin biosynthesis genes in the shoots of B.emeiensis with different height

2.4 參與木質(zhì)素單體聚合的漆酶(LAC)

木質(zhì)素單體在細胞質(zhì)中形成后，需要運輸?shù)郊毎谶M行聚合反應生成木質(zhì)素。LAC被報道參與植物木質(zhì)素的聚合反應[3]。在慈竹筍轉錄組數(shù)據(jù)庫中，有51條假定編碼LAC的序列被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫功能注釋，分別與17個水稻LAC基因如OsLAC3、5、22、25等同源。由圖4知，在4個不同高度慈竹筍中，大部分LAC基因隨著筍的伸長而表達上調(diào)，上調(diào)表達程度比下調(diào)表達程度高。差異表達分析顯示10 vs 100和10 vs 150聚為一簇，表明100和150 cm生長高度慈竹筍中LAC同源基因表達情況相近，而與50 cm樣品差異較大。隨著筍伸長，LAC5、LAC10、LAC11和LAC22同源基因的表達明顯上調(diào)；而LAC17、LAC19、LAC24、LAC25呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。將這些差異表達基因與已知水稻LAC同源基因進行了聚類分析，結果表明上調(diào)的LAC基因與下調(diào)的LAC基因分別聚在a、b兩個亞簇上，呈現(xiàn)明顯的系統(tǒng)進化差異(圖4)。

2.5 差異表達基因的qRT-PCR分析

根據(jù)木質(zhì)素生物合成相關差異表達基因熱圖分析，選擇4個差異表達基因LAC5(CL33Contig7)、CADH2(CL17216Contig1)、4CL3(T3Unigene34303)和PAL1(CL56Contig4)，進行qRT-PCR驗證。

如圖5所示，在基部第二個節(jié)間，LAC5、CADH2、4CL3和PAL的表達均隨著筍的伸長而明顯增加。尤其170 cm筍中這4個基因的相對表達量是30cm和50cm筍的數(shù)十到數(shù)百倍，表明這4個差異表達基因的表達水平可能直接影響著筍的木質(zhì)素含量。

表2 RT-PCR引物

圖4 不同生長高度的慈竹筍中LAC的差異表達熱圖(log2值，A)和系統(tǒng)進化分析(B)Fig.4 The heat map of(log2 value,B) of LAC differential expressions in the shoots of B.emeiensis with different height and their phylogenetic analysis

圖5 不同高度筍中部分木質(zhì)素基因的表達Fig.5 The expression of lignin genes in shoots with different height(P<0.01)

3 討論

對竹稈的解剖研究表明，竹子維管組織形成較早，未伸出地面的毛竹筍的基部節(jié)間已經(jīng)有可見的木質(zhì)部導管和基本的維管束組織出現(xiàn)[20]。毛竹筍的纖維組織的木質(zhì)化，從竹稈6 m左右時開始[10]。與毛竹相比，慈竹筍纖維細胞的木質(zhì)化發(fā)生較早。在50 cm高的慈竹筍基部就出現(xiàn)了木質(zhì)化的纖維細胞，隨著筍高度的增加，木質(zhì)化程度加深(圖1B)。對慈竹早期發(fā)育過程中木質(zhì)素生物合成基因的表達水平分析也表明，大部分木質(zhì)素基因的表達水平在50、100和150 cm筍中較為接近，而與較幼嫩10 cm筍距離較遠。因此早期伸長階段的慈竹筍是研究生木質(zhì)素合成和積累的理想模型。

竹類植物含有較多的木質(zhì)素含量，這可能是由木質(zhì)素合成關鍵酶的數(shù)量和表達水平上的差異引起的。在所有已報道的巨龍竹、麻竹和毛竹等竹類植物轉錄組中，除了Peroxidase外，LAC和4CL轉錄子是最顯著的，另外也有較多數(shù)量的假定編碼PAL、CAD和CCR的序列被檢測到。在慈竹中，我們檢測到了37個4CL，26個PAL和25個CAD轉錄子，其數(shù)量均明顯高于其他已報道的竹類植物(表1)。另外，慈竹筍中可檢測到34個CCR轉錄子，雖然少于巨龍竹(47個)，但明顯高于麻竹(10個)和毛竹(19個)。另外，在慈竹筍中沒有檢測到5-羥基松柏醛O-甲基轉移酶相關(5-hydroxyconiferyl aldehyde O-methyltransferase,AldOMT)的轉錄子，這與在麻竹、毛竹、巨龍竹中的研究結果一致(表1)，可能是由于竹類植物中其它表達的甲基轉移酶取代了AldOMT的活性，這些特征可能是竹類植物獨有的，其中內(nèi)在的調(diào)控機制需要進一步的研究加以闡明。

木質(zhì)素主要沉積在次生壁上，對于細胞乃至整個植株都起到支撐的作用，與慈竹筍的快速生長關系緊密。轉錄組數(shù)據(jù)和RT-PCR分析表明，在4個不同高度慈竹筍中，控制木質(zhì)素生物合成碳流入口的苯丙酮酸途徑中的一些關鍵酶基因如PAL和4CL，以及一些參與特異木質(zhì)素單體合成的CCR和CAD基因呈現(xiàn)較高的相對表達豐度，其RPKM值在162～698。PAL、4CL、和CAD基因的上調(diào)表達，表明在筍的早期生長過程中木質(zhì)素就已經(jīng)開始合成，該現(xiàn)象與筍的快速生長需要機械強度增加[21]的結果相一致。LAC(漆酶)介導的木質(zhì)素單體的聚合是木質(zhì)化過程中必要的一個步驟。而且，在植株發(fā)育的過程中漆酶能在一定程度上調(diào)控維管束的木質(zhì)化[22]，LAC為調(diào)控目標的木質(zhì)素工程是改良能源植物的一個新的可行途徑[3]。與其他已報道的竹類植物類似，慈竹筍中檢測到51條假定編碼LAC的序列。隨著筍的伸長，a亞簇上LAC同源的基因表達上調(diào)，而b亞簇上LAC同源的基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(圖5)。這些結果表明，這些木質(zhì)素合成基因的表達存在時空差異，木質(zhì)素合成和積累可能存在多基因的協(xié)調(diào)作用。

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