朱李奎 唐 亮 趙貝貝 路兆庚 王 莉*

(1.揚州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,揚州 225009； 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院,林芝 860000)

杉木(Cunninghamialanceolata)雌雄異株，風(fēng)媒傳粉植物，現(xiàn)在被廣泛栽培于亞洲各地以及其他地區(qū)，是典型亞熱帶樹種。杉木應(yīng)用廣泛，涉及建筑、橋梁、家具、木制品等多個領(lǐng)域，相比于其他用材樹種，具有干形通直、木材耐腐蝕，生長速度快、病蟲害少、易加工等特點[1]。因此，杉木成為我國南方最主要的用材樹種，也是我國南方造林面積最大的樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。

近幾十年來，對于杉木的研究主要集中在森林培育[2～4]、生理生態(tài)[5～8]、生殖生物學(xué)[9～12]、遺傳育種[13～16]等方面。而對于杉木雄性生殖器官發(fā)育的研究主要集中在小孢子葉球發(fā)育以及雄性不育的機(jī)理研究等，如徐進(jìn)[17]等對杉木花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的細(xì)胞學(xué)特性及異常現(xiàn)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)杉木四分體分裂方式主要是單平面分裂，導(dǎo)致花粉敗育的原因可能是由于在杉木花粉形成過程中減數(shù)分裂異常引起的遺傳物質(zhì)不均衡分配。呂洪飛[18～20]等對杉木雄性不育株的小孢子葉球及小孢子囊發(fā)育進(jìn)行了初步研究。以上研究為揭示杉木生殖生物學(xué)特點及其系統(tǒng)發(fā)育位置提供了基礎(chǔ)資料。然而，杉木小孢子葉球的生長發(fā)育及其散粉的過程尚未見報道。系統(tǒng)研究和觀察杉木小孢子葉球發(fā)育及其散粉規(guī)律對深入理解杉木傳粉生物學(xué)具有重要意義。本研究采用體視鏡觀察、掃描電鏡和半薄切片等方法，從形態(tài)學(xué)與組織學(xué)角度系統(tǒng)觀察了杉木小孢子葉球的發(fā)育及散粉過程。主要包括以下四個方面的研究：小孢子葉球的形態(tài)特征、小孢子葉的形態(tài)特征、小孢子囊及囊壁的組織分化和散粉過程的形態(tài)變化。通過研究杉木小孢子葉球發(fā)育過程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與組織分化，為杉木生殖發(fā)育、有性繁殖以及系統(tǒng)演化研究提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗所用杉木取自江蘇省揚州市瘦西湖風(fēng)景區(qū)(32°24′N,119°25′E)內(nèi)，樹體健壯，生長發(fā)育良好，無病蟲害。在2012年1月下旬～2012年4月期間內(nèi)，對生長條件一致的杉木進(jìn)行連續(xù)取樣，觀察杉木小孢子葉球的發(fā)育及散粉的過程，并將采集的新鮮樣品用戊二醛和FAA固定液固定后放入4℃冰箱中保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 數(shù)碼相機(jī)觀察法

定期觀察杉木小孢子葉球的形態(tài)發(fā)育情況，每隔3天觀察一次，并用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。在散粉期，每天拍攝一次。

1.2.2 體視鏡觀察法

將即將散粉的小孢子葉球置于體視鏡(型號：Motic SMZ-168)下，每隔1 h觀察一次散粉情況并拍照記錄。

1.2.3 掃描電鏡觀察法

將傳粉前后的杉木小孢子葉球浸入FAA固定液中固定后放入4℃冰箱中保存。樣品取出后，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液清洗3次，每次15 min，梯度丙酮(50%、70%、80%、90%、95%、100%)各處理15 min，100%丙酮加無水硫酸鈉2次各處理15 min，丙酮與乙酸異戊酯按比例2∶1、1∶1、1∶2混合液脫水處理各10 min，純乙酸異戊酯處理一次30 min。脫水后在臨界點干燥儀(型號：HCP-2)上干燥，然后在離子濺射噴鍍儀(型號：SCD 500)上噴金20 min，最后將樣品置于場發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號：S-4800Ⅱ)下掃描并拍照[21]。

1.2.4 半薄切片觀察法

2012年2月20日～3月15日期間，對杉木的小孢子葉球進(jìn)行連續(xù)取樣，樣品用2.5%戊二醛固定液固定后置于4℃冰箱中保存一周左右。樣品取出后，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液清洗3次，每次15 min，梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%)脫水處理各15 min，乙醇與丙酮2∶1、1∶1、1∶2混合液脫水處理各15 min，純丙酮脫水處理一次15 min，脫水處理后用spurr樹脂浸透包埋。包埋后的樣品進(jìn)行修樣后，用超薄切片機(jī)(型號：ULTnb RACUTE)進(jìn)行樣品切片，切片后用甲苯胺藍(lán)染色后置于光學(xué)顯微鏡(型號：LEICADMLS2)下觀察并拍照[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木雄球花發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)特征

通過對揚州地區(qū)所試杉木的小孢子葉球進(jìn)行連續(xù)兩年形態(tài)學(xué)(圖1:A)和物候期(圖1:B)的觀察發(fā)現(xiàn)，1月下旬，杉木的雄花芽著生于枝條頂端，花芽呈綠色，且外部有芽鱗包被(圖1:C)。2月上旬，雄花芽的芽鱗逐漸張開，小孢子葉球逐漸伸到芽鱗外，每個雄花芽上著生約20個小孢子葉球，單個小孢子葉球體積較小，其上著生約50個小孢子葉(圖1:D)。2月中下旬，小孢子葉球向下生長，幾乎全部裸露在芽鱗外，小孢子葉球之間的間隙逐漸增大(圖1:E)。3月上中旬，小孢子葉球體積增加明顯，部分芽鱗被小孢子葉球擠壓脫落，小孢子葉的體積也持續(xù)增加，小孢子葉之間的輪廓變得明顯(圖1:F)。3月中下旬，芽鱗幾乎全部脫落，小孢子葉球上的小孢子葉清晰可辨，變?yōu)樯罴t色(圖1:G)，此時小孢子葉球發(fā)育成熟，杉木進(jìn)入散粉期。進(jìn)入散粉期后，一般處于雄球花上部的小孢子葉球首先散粉，小孢子葉苞片張開，花粉自然散出(圖1:H～I(xiàn))，散粉完成后，只剩苞片還著生在主軸上(圖1:J)。綜上，在形態(tài)學(xué)上，杉木小孢子葉球發(fā)育是一個體積逐漸變大、顏色逐漸加深的過程，但在散粉過程中，散粉首先從雄球花的上部的小孢子葉球開始，且散粉的過程較快。

圖1 杉木小孢子葉球發(fā)育進(jìn)程 A.杉木小孢子葉球；B.杉木小孢子物候期觀察；C～J.杉木小孢子葉球發(fā)育及散粉過程(C.雄花芽形成；D～G.小孢子葉球生長發(fā)育；H～J.小孢子葉球散粉過程) MB.雄花芽；MC′.小孢子葉球；SB.芽鱗Fig.1 The development process of male cones in C.lanceolata A. The male cones of C.lanceolata; B. Phenology of male cones in C.lanceolata; C-J. The development and the the process of pollen release of male cones in C.lanceolata(C. The formation of male flower bud; D-G. Growth and development of microstrobilus; H-J. The process of pollen release in strobile) MB. Male flower bud; MC′. Male cone; SB. Subtending bract

2.2 杉木小孢子葉球及小孢子囊壁發(fā)育過程的觀察

杉木的小孢子葉球由小孢子葉及其外部的鱗片組成，單個小孢子葉球的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，10月中旬，杉木小孢子葉球形成，呈綠色，著生于新枝頂端，長約500 μm，寬約300 μm，小孢子葉螺旋排列在主軸上(圖2:A～B)。11月中旬，小孢子葉球體積增大，長約2 mm，寬約1.5 mm，小孢子葉的體積也隨之增大，外部的鱗片逐漸張開(圖2:C～D)。到下年的1月中下旬，小孢子葉球體積進(jìn)一步增加，長約4 mm，小孢子囊的體積隨著小孢子葉的發(fā)育不斷生長(圖2:E)。2月，小孢子葉不斷增大，逐漸突出到芽鱗外(圖2:F)。3月中旬，小孢子葉球成熟，體積到達(dá)最大，長約9 mm，寬約5 mm，小孢子葉幾乎全部突出到芽鱗外(圖2:G～H)。每個小孢子葉一般由3個小孢子囊組成，3個小孢子囊呈三角形排列，每個小孢子囊長約300 μm，寬約60 μm(圖2:I)。至此，杉木小孢子葉球成熟，即將進(jìn)入散粉期。

杉木花粉是由小孢子囊內(nèi)散出的，因此囊壁的發(fā)育過程對花粉散出有著重要作用。杉木的小孢子囊壁通常由3～4層細(xì)胞組成，分別為最外層的1層表皮細(xì)胞、1～2層中間層細(xì)胞和1層絨氈層細(xì)胞。對杉木發(fā)育過程中不同時期的小孢子囊進(jìn)行半薄切片處理，觀察其囊壁的生長發(fā)育過程。發(fā)現(xiàn)在2011年10月中旬，小孢子囊壁還沒有分化形成，囊壁之間沒有明顯分層(圖2:J)，表明此時囊壁還未分化。至2012年1月中旬，發(fā)現(xiàn)囊壁的表皮細(xì)胞首先分化形成，并向內(nèi)分化出2～3層細(xì)胞，這幾層細(xì)胞緊靠表皮細(xì)胞，與中間的小孢子母細(xì)胞有明顯的界限，表皮細(xì)胞的體積明顯大于剛分化出的中間層的細(xì)胞(圖2:K)。2月上旬，已經(jīng)分化出的2～3層細(xì)胞繼續(xù)分化形成中層和絨氈層，絨氈層呈線性排列，細(xì)胞成長條形，細(xì)胞核較為明顯，而中層細(xì)胞呈不規(guī)則排布散狀排列(圖2:L)。2月下旬，絨氈層細(xì)胞體積增大，內(nèi)突至小孢子囊內(nèi)，細(xì)胞形狀也由原來的長條形變?yōu)閳A形(圖2:M)。3月上旬，中層和絨氈層細(xì)胞逐漸解體(圖2:N)，到3月中下旬時，中層和絨氈層完全解體消失(圖2:O)。

2.3 杉木小孢子葉球的散粉機(jī)制

對杉木小孢子葉球傳粉前后的形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在散粉之前，各小孢子葉螺旋著生在主軸上，排列緊密，幾乎沒有空隙，且顏色呈現(xiàn)綠色(圖3:A)。散粉開始后，處于小孢子葉球基部的小孢子葉首先張開散粉，顏色由綠逐漸變黃(圖3:B)。隨著散粉進(jìn)程的深入，小孢子囊從基部開始向頂端散粉(圖3:C)。散粉后期所有小孢子囊的花粉全部散出，小孢子葉變?yōu)樯罴t色，小孢子葉從主軸上脫落(圖3:D)。整個散粉過程約經(jīng)歷18 h，前8 h散粉速度較慢，只有很少的花粉散出，隨后散粉速度迅速增大，直到全部散出。

同時，對小孢子囊散粉過程進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，在散粉前，著生在小孢子葉上的3個小孢子囊緊密排列在一起，呈佛手狀(圖3:E)。隨后，小孢子囊彼此間分離(圖3:F)。散粉開始，小孢子囊間的距離進(jìn)一步加大，小孢子囊沿開裂口從基部開始破裂，花粉從開裂口散出(圖3:G～I(xiàn))。隨著散粉過程不斷進(jìn)行，首先位于中間的小孢子囊完全破裂，花粉散出，隨后兩邊的小孢子囊也開始散粉(圖Ⅲ:J～M)。最后，3個小孢子囊全部破裂，花粉完全散出(圖3:N～P)。單個小孢子囊的散粉過程經(jīng)歷8～10 h，一旦開裂口打開，花粉在20 min內(nèi)呈爆炸狀散出。

最后，對杉木散粉過程中的小孢子囊壁進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)在3月中旬，杉木的小孢子囊壁外壁向上形成許多帶狀突起加厚(圖3:T)，而開裂口處的囊壁卻沒有加厚，小孢子囊壁首先在開裂口破裂，小孢子囊沿開裂口縱向開裂，成熟花粉從開裂口散出(圖3:Q～S)，散粉完成。

3 討論

雄球花是裸子植物重要的生殖器官，其形態(tài)特征在傳粉過程中起著至關(guān)重要的作用[23～24]。杉木的雄球花為柔荑狀，與冷杉(Abiesfaxoniana)、大別山五針?biāo)?Pinusdabeshanensis)、羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)等裸子植物相同。這種花序的特點是花軸上著生許多無柄或是短柄的單性小花(雄花或雌花)，其中雄花為柔荑花序的比較多見。有的花軸柔軟下垂如水杉(Metasequoiaglyptostroboides)，有的花軸直立如蘇鐵(CycasrevolutaThunb.)等。Urzay[25]指出在風(fēng)媒傳粉植物中，雄花呈長絲狀或葇荑狀的植物能夠利用自身周圍產(chǎn)生的氣流動力將成熟花粉從孢囊內(nèi)有效地散出。本研究中我們發(fā)現(xiàn)杉木雄球花的花軸直立，散粉后雄球花枯萎，但仍然長期宿存在枝上。杉木的雄球花通常分布于樹冠的外部，著生于新枝的頂端。這點不同于小孢子葉球著生于葉腋處的羅漢松等，杉木的這種分布和著生方式可能是為了使雄球花更多的裸露在高空開闊處，在傳粉過程中能夠有效的降低葉片對花粉散出的阻礙。同時，杉木樹體較高也有利于散出的花粉借助風(fēng)力遠(yuǎn)距離傳播，這些結(jié)構(gòu)上的變化顯然有利于提高散粉效率，可見杉木在長期的演化過程中，形成了許多有利于風(fēng)媒傳粉的結(jié)構(gòu)特征。

圖2 杉木小孢子葉球掃描電鏡及囊壁發(fā)育過程的結(jié)構(gòu)觀察 A～I(xiàn).杉木單個小孢子葉球掃描電鏡觀察(A～H. 10月中旬至翌年3月中旬，小孢子葉球生長發(fā)育過程；I.成熟小孢子葉由3個小孢子囊和一個苞片組成)；J～O.杉木小孢子囊壁發(fā)育過程半薄切片觀察(K. 1月中旬，小孢子囊壁表皮細(xì)胞已經(jīng)形成；L～M. 2月，絨氈層形成及生長；N～O. 3月，絨氈層逐漸解體與消失) MC′.小孢子葉球；Sg.小孢子囊；EC.表皮細(xì)胞；TC.絨氈層細(xì)胞；P.花粉粒Fig.2 The SEM of the microstrobilus and the anatomical structure of sac wall of male cones in C.lanceolata A-I. SEM images of single male cone of C.lanceolata(A-H. From mid-October to late mid-March, the process of growth and development of male cone in C.lanceolata; I. Mature microsporophyll consists of three microsporangiums and one bract.); J-O. The semi-thin slice observation on the developmental process of sporangial wall in C.lanceolate(K. In mid-January, the epidermal cell of sporangial wall have formed; L-M. In February, the formation and growth of tapetum; N-O. In March, the tapetum gradually disintegrated and disappeared.) MC′. Male cone; Sg. Sporangiole; EC. Epidermal cell; TC. Tapetum cell; P. Pollen grain

圖3 杉木小孢子葉球的散粉過程及解剖結(jié)構(gòu) A～D.杉木單個小孢子葉球的散粉過程；E～P.杉木小孢子囊的散粉過程；Q～T.杉木小孢子葉囊壁的開裂特征 MA.主軸；SW.小孢子囊壁；Sg.小孢子囊；P.花粉；DL.開裂口Fig.3 The process of pollen release and the anatomical structure of microsporangium wall of male cone in C.lanceolata A-D. The process of pollen release of single male cone in C.lanceolata; E-P. The process of pollen release of the microsporangia in C.lanceolata; Q-T. The dehiscence of microsporophyll wall during pollen release in C.lanceolata MA. Main axis; SW. Sporangial wall; Sg. Microsporangium; P. Pollen; DL. Dehiscence line

此外，通過對杉木單個小孢子葉球和小孢子葉散粉過程的觀察發(fā)現(xiàn)，散粉前小孢子葉和小孢子囊緊密排列在一起，散粉過程中，小孢子葉松散，位于小孢子葉上的3個小孢子囊也彼此分開，首先位于中間的小孢子囊從基部沿著開裂口到頂端依次開裂，然后位于兩側(cè)的小孢子囊再依次開裂，最后花粉完全散出。這種開裂順序可以減少惡劣天氣對傳粉的影響，延長散粉時間，彌補花期不同步造成的花粉損失。

小孢子囊的開裂對花粉的成功散出起著關(guān)鍵作用[26]。多數(shù)被子植物的花藥壁由4層細(xì)胞組成，由外到內(nèi)依次為：表皮、內(nèi)壁、中層和絨氈層[27]，花藥的開裂機(jī)制包括一系列的物理和生理過程。例如，水稻(Oryzasativa)花藥的開裂是在內(nèi)部花粉發(fā)育生長的壓力、囊壁表皮向內(nèi)彎曲的收縮力以及囊壁具有加厚帶的內(nèi)壁向外的彎曲力共同作用下完成的[28]。Keijzer等[29]通過對玉米(maize)花藥開裂機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，玉米是通過酶解作用使其花藥開裂。而裸子植物的孢囊壁一般由3層細(xì)胞組成，如在水杉中[30]，孢囊壁由表皮細(xì)胞、中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞組成，其中層細(xì)胞隨著小孢子囊的發(fā)育而解體退化。本研究的結(jié)果與水杉相似，杉木的小孢子囊壁由外層細(xì)胞、中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞組成，3月中下旬，中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞瓦解，小孢子囊壁外壁向上形成許多帶狀突起加厚，而在開裂口處囊壁卻沒有加厚，小孢子囊壁首先在開裂口破裂，小孢子囊沿開裂口縱向開裂，成熟花粉從開裂口散出。這種散粉機(jī)制的形成可能是由于細(xì)胞失水，胞內(nèi)的細(xì)胞液內(nèi)聚力增加，使細(xì)胞徑向壁間產(chǎn)生一定的拉力，而無帶狀加厚的囊壁是應(yīng)力的集中點，抗壓能力薄弱，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步失水后，便從此處破裂。外壁的加厚可以防止花粉在成熟增大時對囊壁形成機(jī)械傷害，保證花粉質(zhì)量；開裂口的囊壁沒有加厚說明在花粉成熟時有利于其從開裂口散出，減少阻力。這些結(jié)果表明盡管水杉是落葉樹種、杉木是常綠樹種，但兩者具有相似的散粉機(jī)制。

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