吳元圣，李 雄，楊永平 ，楊永紅

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201；3 中國科學(xué)院 昆明植物研究所西南野生生物種質(zhì)資源庫, 昆明 650201)

植物必需礦質(zhì)元素(如Mg、Fe、Na、Cu、Zn等)在植物中起著廣泛的作用，適量的礦質(zhì)元素對維持植物的正常生長發(fā)育有著重要作用，若植物的生長過程中缺少某種必需元素，則植物會發(fā)生相應(yīng)的生理生化變化而影響其生長發(fā)育[1-3]。但是這些元素(特別是微量元素)過量的積累也會對植物造成毒害[4]。此外，由于Cd、Pb和Hg等植物非必需金屬元素和某些必需礦質(zhì)元素有類似的化學(xué)性質(zhì)，同樣會被植物吸收，從而對植物產(chǎn)生毒害作用[5]。近年來隨著重金屬污染事件的頻繁發(fā)生，重金屬污染的防治工作越來越受到重視。重金屬污染土壤的修復(fù)是指利用物理、化學(xué)、生物或組合的方法來固定、富集或去除重金屬使其濃度降低至無害水平[6]。物理化學(xué)方法通?？梢詭砜焖俚男Ч蟛糠殖杀靖咔視a(chǎn)生二次污染[7]，因此難以廣泛應(yīng)用。生物修復(fù)指通過生物體的代謝活動降低土壤中的重金屬濃度，主要通過微生物修復(fù)和植物修復(fù)來進(jìn)行[8]。微生物修復(fù)具有成本低、環(huán)保效益和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[9]。但是微生物修復(fù)本身也存在問題，例如微生物生長的環(huán)境和收集細(xì)菌等問題[10]。因此，植物修復(fù)技術(shù)已成為近年來的主要選擇[11-12]。植物修復(fù)是利用植物對重金屬的吸附或吸收來降低土壤重金屬的生物有效性[13]。植物修復(fù)效率很大程度上依賴于植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因此研究植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的分子機(jī)制，挖掘其中的關(guān)鍵基因具有重要意義。已有研究表明，一些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子，這些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P型ATP酶、陽離子擴(kuò)散促進(jìn)蛋白(CDF)家族和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[14]。

重金屬ATP酶(HMA)是P型ATP酶的亞家族之一，能夠利用ATP水解釋放的能量轉(zhuǎn)運(yùn)多種重金屬穿越細(xì)胞膜[14]，是超富集植物依賴的一類重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[15]。在擬南芥和水稻中分別鑒定出了8個(gè)和9個(gè)HMA蛋白，分別命名為AtHMA1～AtHMA8和OsHMA1～OsHMA9，根據(jù)主要轉(zhuǎn)運(yùn)底物和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以分為2個(gè)亞類：Zn/Cd/Co/Pb亞類(包括AtHMA1～AtHMA4和OsHMA1～OsHMA3)和Cu/Ag亞類(包括AtHMA5～AtHMA8和OsHMA4～OsHMA9)[16]。研究表明，HMA家族在維持植物正常條件下微量金屬元素的平衡和提高重金屬耐受性方面發(fā)揮重要的作用[17]。例如：水稻OsHMA2基因突變體對Zn2+和Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯降低[18]。擬南芥和水稻中AtHMA3和OsHMA3基因都能夠向根液泡中轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+，從而減少Cd2+向地上組織的轉(zhuǎn)移[19-21]。AtHMA4基因在調(diào)節(jié)擬南芥中Cd2+和Zn2+的含量具有重要作用，能夠介導(dǎo)Cd2+和Zn2+通過木質(zhì)部向莖尖的轉(zhuǎn)運(yùn)[22-23]。與大多數(shù)HMA成員功能不同的是，水稻中OsHMA9基因能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的Cd、Zn、Pb等重金屬排至胞外[23]。盡管對于模式植物擬南芥和水稻中HMA基因的功能研究開展較早，研究也較為深入，但關(guān)于其他植物特別是重金屬超富集植物中HMA基因的功能研究還相對較少。

十字花科物種在探索金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能方面顯示出明顯的優(yōu)勢。其原因在于(1)該類植物包括模式植物(擬南芥)；(2)許多重要的蔬菜和油料作物基因組數(shù)量不斷增加；(3)十字花科植物對2種重要的非生物脅迫(鹽脅迫和重金屬積累)的耐受性差別很大[24-26]。其中，蕪菁(Brassicarapavar.rapa)是十字花科蕓薹屬能形成肉質(zhì)根的2年生草本植物，在歐洲、亞洲和美洲均有栽培[27]。蕪菁和其他十字花科蔬菜作物一樣，是土壤中重金屬遷移到動物和人體的重要媒介，在重金屬和植物的相互作用研究中具有重要角色。前期研究發(fā)現(xiàn)蕪菁屬于Cd2+高積累型植物[28]，但關(guān)于蕪菁對重金屬的耐受或轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制的研究還很少。本研究從蕪菁中克隆得到HMA家族的1對同源基因BrrHMA2.1和BrrHMA2.2，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步研究HMA家族基因在蕪菁吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為來自四川省鄉(xiāng)城縣當(dāng)年采集的成熟蕪菁種子。將種子播種在盛有混合營養(yǎng)土的塑料花盆里，每盆播種約3～4粒，共40盆；然后在23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)36 h，待種子萌發(fā)后，移入溫室(晝夜溫度20/25 ℃；晝夜時(shí)間: 8 h/16 h；相對濕度75%～80%)培養(yǎng)5～6周后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成選取生長良好的蕪菁幼苗，剪取其幼嫩葉片，采用總RNA提取試劑盒(Eastep Super，上海)從蕪菁樣品中提取總RNA，取RNA樣品3 μg，反轉(zhuǎn)錄(Promega，上海)合成cDNA第1條鏈。

1.2.2BrrHMAs基因克隆根據(jù)蕪菁轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果預(yù)測的CDS序列，設(shè)計(jì)克隆引物BrrHMA2.1-F(5′-ATGGCGACCAAGAACGAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R(5′-ACAGTCACCACCATGAGTGA-3′)，BrrHMA2.2-F(5′-ATGGCGTCCAAGAACGA-TAA-3′)和BrrHMA2.2-R(5′-ATGATCACCACCATGCATGA-3′)，以cDNA第1條鏈為模板進(jìn)行BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因全長序列的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物利用DNA凝膠回收試劑盒(TransGen Biotech，北京)進(jìn)行純化回收。將純化產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測序。

1.2.3BrrHMAs基因的序列分析利用Swiss Institute of Bioinformatics 網(wǎng)站的ExPASy翻譯工具(http://au.expasy.org/tools/dna.html)將全長cDNA序列翻譯成蛋白序列；利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Nucleotide Blast進(jìn)行序列比對分析；用ProtParam工具(http://expasy.org/tools/)在線預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量大小、氨基酸組成、等電點(diǎn)及疏水性。用GeneDoc軟件進(jìn)行同源序列比對，InterPro網(wǎng)站預(yù)測其結(jié)構(gòu)域。用MEGA6軟件選擇鄰接法(neighbor～joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.4表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位以測序正確的BrrHMA2.1/pMD18-T和BrrHMA2.2/pMD18-T重組質(zhì)粒為模板，用引物BrrHMA2.1-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGA-CCAAGAAC GAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCACTCATGGTGGTGACT-GT-3′)，BrrHMA2.2-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGTCCAAGAACGATAA-3′)和BrrHMA2.2-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCATGCATGGTGGTG-ATCAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物使用DNA凝膠回收試劑盒純化。將PCR純化產(chǎn)物以及空的101GFP載體用BamH I內(nèi)切酶單酶切，并用連接酶(ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，南京)連接30 min，構(gòu)建GFP- BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中并測序確認(rèn)。構(gòu)建好的質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞中。將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105通過注射液(含1/2MS、50%蔗糖、0.3% Silwet、乙酰丁香酮，pH 5.7)注射到本氏煙草(NicotianabenthamianaL.)葉片中，正常生長3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片下表皮的綠色熒光蛋白(GFP)熒光。

1.2.5BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在蕪菁不同生長時(shí)期及重金屬脅迫處理下的表達(dá)分析利用Step one plusTm熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。選取生長18、36、42和50 d的蕪菁幼苗和用不同金屬脅迫處理(10 mg·L-1MgCl2·6H2O、 2 mg·L-1ZnSO4·7H2O、5 mg·L-1CuSO4·5H2O、2.5 mg·L-1FeCl2·4H2O、2 mg·L-1CoCl2·6H2O、2.5 mg·L-1NaCl、2 mg·L-1CdCl2·2.5H2O)的蕪菁幼苗，分別提取葉片和根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測2個(gè)基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL，主要包括：EvaGreen 2X qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)ree-H2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃ 預(yù)變性30 s，94 ℃ 變性5 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。以蕪菁Tubulin基因作為內(nèi)參，qPCR反應(yīng)所用引物為qBrrTUB2-F(5′-AGGCGTGTGAGTGAGCAG-TT-3′)和qBrrTUB2-R(5′-CATCTCGTCCATTCCTTC-ACCTGT-3′)；qBrrHMA2.1-F(5′-AAGAACCGTCATCGTCGTCC-3′)和qBrrHMA2.1-R(5′-GAGAAGTACGCCGGAAACCA-3′)；qBrrHMA2.2-F(5′-GTTTCCGGCGTACTTCTCCT-3′)和qBrrHMA2.2-R(5′-GTGACGATGAACTCGCCTCT-3′)。

1.2.6數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)量；利用SPSS 18軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用單因素ANOVA檢驗(yàn)；利用SigmaPlot 10.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrrHMAs基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以蕪菁cDNA為模板，設(shè)計(jì)全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后送樣品測序，得到BrrHMA2.1和BrrHMA2.2完整的cDNA序列。

Marker. DL5000

BrrHMA2.1基因的全長開放閱讀框?yàn)? 619 bp(圖1)，編碼872個(gè)氨基酸，將其命名為BrrHMA2.1，序列提交到GenBank，登錄號為MG_283237。將該蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白和白菜(Brassicarapavar.pekinensis)HMA2(登錄號為XM_009129842)具有99%的相似性。BrrHMA2.2基因的全長開放閱讀框?yàn)? 724 bp(圖1)，編碼907個(gè)氨基酸，GenBank登錄號為MG_283238，該蛋白和白菜HMA2-like(登錄號為XM_009139642)具有99%的相似性。

ProtParam工具預(yù)測BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白的分子量分別為94.19和97.45 kD，理論等電點(diǎn)分別為6.69和7.64。序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有1個(gè)HMA保守結(jié)構(gòu)域。BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白具有6個(gè)跨膜螺旋區(qū)(圖2)。

2.2 BrrHMAs基因的進(jìn)化分析

采用MEGA6軟件的NJ法對BrrHMA2.1、BrrHMA2.2及AtHMA家族10個(gè)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)。結(jié)果表明，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2與AtHMA2(GenBank ANM67783.1)的分支關(guān)系較近。序列相似的基因可能具有相似的功能。

因此，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2基因可能與AtHMA2基因功能相似。

2.3 BrrHMAs蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為了研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在細(xì)胞中的作用位置， 本研究構(gòu)建GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌EHA105菌株將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。轉(zhuǎn)化3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片下表皮中表達(dá)載體的表達(dá)情況(圖4)。研究表明，GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合蛋白在細(xì)胞膜上特異表達(dá)。

2.4 BrrHMAs基因在不同生長時(shí)期的表達(dá)分析

為研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在不同生長時(shí)期的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)取4個(gè)不同生長時(shí)期蕪菁的根和葉，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其表達(dá)量(圖5)。研究表明，蕪菁隨著生長時(shí)間的增加，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在葉中的表達(dá)量降低，根中的表達(dá)量增加。BrrHMA2.1基因在蕪菁生長18 d，葉中的表達(dá)量相對于根中較高(P< 0.05)；生長36 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低1倍，根的表達(dá)量增加5倍；生長43 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低1倍，根的表達(dá)量增加19倍；生長50 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低2倍，根的表達(dá)量增加15倍；BrrHMA2.2基因與BrrHMA2.1基因表達(dá)結(jié)果相似，均在蕪菁生長18 d時(shí)，葉中表達(dá)量高，隨著生長時(shí)間的增加，在根中的表達(dá)量高于葉(P< 0.05)。其中生長43 d時(shí)，2個(gè)基因在根中的表達(dá)量最高。

圖3 BrrHMA2.1、BrrHMA2.2與擬南芥AtHMA家族氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of BrrHMA2.1, BrrHMA2.2 and Arabidopsis AtHMA family amino acid sequence

2.5 BrrHMAs基因在不同金屬脅迫下的表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)采用多種金屬脅迫處理，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測BrrHMA2.1和BrrHMA2.2在不同金屬脅迫條件下的表達(dá)(圖6)。研究發(fā)現(xiàn)，不同金屬脅迫條件下，蕪菁BrrHMA2.1基因在葉中均表現(xiàn)為下調(diào)，明顯受多種金屬的抑制(P< 0.05)，根中均表現(xiàn)為上調(diào)；BrrHMA2.2在葉中均表現(xiàn)為上調(diào)，Cu2+、Na+在根中表現(xiàn)為上調(diào)，其他均為下調(diào)表達(dá)。其中，BrrHMA2.1基因在Cd2+、Cu2+、

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母表示不同金屬處理相同組織在0.05水平存在顯著性的差異(P<0.05)The data in the figure is the mean ± standard error, and the different normal letters indicate that there is a significant difference at the 0.05 level for the same tissue treated by different metals(P<0.05)

Na+處理后的葉中顯著被下調(diào)表達(dá)(P< 0.05)；Mg2+、Zn2+、Na+處理后的根中顯著上調(diào)表達(dá)(P< 0.05)；BrrHMA2.2基因在Cd2+處理后的葉中和Cu2+、Na+處理后的根中顯著表達(dá)(P< 0.05)。與處理前相比，BrrHMA2.1基因Cd2+、Cu2+、Na+在處理后葉中的表達(dá)量下調(diào)至未處理時(shí)的1倍；BrrHMA2.1基因Mg2+、Zn2+、Na+在處理后根中的表達(dá)量分別上調(diào)至未處理時(shí)的11、12、13倍。BrrHMA2.2基因與處理前相比，在葉中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，并且在Cd2+中的表達(dá)量最高上調(diào)至未處理時(shí)的5倍。在根中的Cu2+、Na+表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，分別是對照的4倍和6倍，其他均呈現(xiàn)下調(diào)。由此推測，BrrHMA2.1基因可能參與Cd2+、Zn2+、Na+、Mg2+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，BrrHMA2.2基因可能參與Cd2+、Na+、Cu2+的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討 論

本研究克隆得到蕪菁中HMA2的一對同源基因，相對于擬南芥，蕪菁中HMA2基因發(fā)生了擴(kuò)增，這和已報(bào)道的其他一些基因家族成員的結(jié)果一致[28-29]。這可能是因?yàn)槭忀歼M(jìn)化歷史中發(fā)生的多倍化事件導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)或基因數(shù)目的變化[30]。在植物進(jìn)化過程中，HMA基因數(shù)量的增加可能與金屬耐性和運(yùn)輸?shù)墓δ苡嘘P(guān)。研究發(fā)現(xiàn)蕪菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白都定位于細(xì)胞膜上，且含有HMA2蛋白所有的保守結(jié)構(gòu)域，這表明蕪菁中HMA2基因可能和這些物種HMA2成員具有類似的功能，與擬南芥或水稻的研究結(jié)果一致[30-31]。但是由于不同植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性有著很大差異，因此蕪菁中HMA2基因的作用機(jī)制及2個(gè)同源基因之間的作用關(guān)系值得深入研究。

由于已經(jīng)證明植物HMA基因參與多種重金屬的積累、運(yùn)輸或外排[15]，包括植物微量元素和非必需元素[32-35]，因此它們可能在維持植物礦物質(zhì)營養(yǎng)和抵抗重金屬污染方面發(fā)揮重要作用。蕪菁吸收微量元素和重金屬Cd的能力較高[28]。因此，研究蕪菁對重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制具有重要意義。其中，AtHMA2與金屬具有特別高的親和力作用[36]。AtHMA2基因在Zn2+和Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收過程中具有重要作用[17]。單獨(dú)敲除AtHMA2導(dǎo)致Zn2+從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)減少[17,30]。根據(jù)金屬依賴轉(zhuǎn)運(yùn)酶的特性表明，除了Zn2+之外，其它的Cd2+、Pb2+、Ni2+、Co2+和Cu2+等金屬離子可能被HMA2激活，這種廣泛的金屬選擇性是Zn-ATP酶常見的[37]。由此推測，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因可能同樣參與Zn2+和Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁BrrHMA2.1，BrrHMA2.2基因在不同生長時(shí)期和不同金屬離子處理后在蕪菁的根和葉中均能表達(dá)。其中，隨著生長時(shí)間的增加，2個(gè)基因的表達(dá)量逐漸增加；2個(gè)基因在Zn2+、Cd2+等金屬脅迫下可以誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

目前，還沒有蕪菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因的研究報(bào)道，本研究為后期開展蕪菁重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrrHMA2.1、BrrHMA2.2的生物學(xué)功能研究，深入探討蕪菁體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為蕪菁遺傳育種及提高產(chǎn)量提供新的思路。

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