周天華，丁家璽，徐 皓，陳 琛，2

(1 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723000)

天麻(GastrodiaelataBl.)屬蘭科天麻亞族天麻屬(GastrodiaR. Br.)多年生草本植物，又名赤箭、獨搖芝、離母、定風(fēng)草、白龍皮等。分布于吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、臺灣、河南、湖北、湖南、四川、貴州、云南和西藏。生于海拔400～3 200 m 的疏林下、林中空地、林緣及灌叢邊緣，生長過程中必須先后與小菇屬和蜜環(huán)菌屬2類真菌建立共生關(guān)系。植株高30～200 cm。莖直立，無綠葉，下部被數(shù)枚膜質(zhì)鞘。根狀莖肥厚，塊莖狀，橢圓形至近啞鈴形，具較密的節(jié)[1]。天麻塊莖入藥為中藥天麻(GASTRODIAE RHIZOMA)，是中國名貴中藥材，性甘、平，歸肝經(jīng)，主治功能有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)，可用于小兒驚風(fēng)，頭痛眩暈，肢體麻木等癥狀[2]。

天麻屬下共有13個種，而藥用植物天麻(G.elata)種下又可分為5個變型(form)，分別是紅天麻(G.elataBl. f.elata)、綠天麻(G.elataBl. f.viridisMakino)、烏天麻(G.elataBl. f.glaucaS. Chow)、黃天麻(G.elataBl. f.flavidaS. Chow)與松天麻(G.elataBl. f.albaS. Chow)[1]。這5個變型分布于全國各地，均有馴化栽培。研究表明，天麻的塊莖中存在著多種化學(xué)成分，如酚類、有機酸類、多糖類和甾體類等，其中天麻素(對-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖)是公認的主要藥用活性成分[3]，天麻素的含量也成為了評定天麻質(zhì)量的重要指標。然而，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)天麻不同產(chǎn)地、不同變型間的天麻素含量存在著較大差異[4-5]。

天麻的市場需求量日益上漲，野生天麻已經(jīng)不能滿足市場的需求，雖然大范圍的人工栽培在一定程度上解決了野生天麻稀缺的問題，但也導(dǎo)致了市場上的天麻的種質(zhì)混亂。不同變型間的天麻塊莖在形態(tài)上幾乎沒有區(qū)別，而天麻素的量卻有著較大的差異，導(dǎo)致藥材品質(zhì)良莠不齊，且混偽品泛濫，給天麻的種植栽培和臨床用藥安全帶來了極大的困難。因此，亟需利用DNA分子鑒定的方法，為該藥材良種選用及用藥安全提供重要技術(shù)支撐。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)也稱為簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)，是由1～6 bp的重復(fù)單元串聯(lián)而成一段DNA，并且廣泛分布于核基因組與葉綠體基因中[6]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，SSR技術(shù)已經(jīng)普遍運用于植物遺傳學(xué)的研究中，用來揭示植物樣本間或居群間的遺傳變異或評估種間的遺傳關(guān)系。與其他分子標記技術(shù)相比，由于微衛(wèi)星位點上堿基數(shù)目是可變的并且呈高度的多態(tài)性，以及可以做共顯性的等位基因分析，因此被廣泛應(yīng)用于藥用植物的遺傳背景分析、種質(zhì)資源鑒定和混偽品鑒定[7-9]。盡管藥材在干燥過程中DNA有所降解，但干品仍然帶有足夠多的DNA信息特別是穩(wěn)定的小分子帶,可供鑒別藥材使用。因此，不論新鮮藥材還是干品飲片，或是不同藥用部位，通過DNA分子技術(shù)皆能準確予以鑒別。

本研究利用已開發(fā)的SSR引物對天麻的3種變型進行了群體遺傳分析，并構(gòu)建了天麻種質(zhì)資源的SSR指紋圖譜，為中國傳統(tǒng)中藥材天麻變型間區(qū)分提供了可靠的分子依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用120份樣本采自于陜西省漢中市、貴州省畢節(jié)市、云南省昭通市和湖北省宜昌市。每個地區(qū)采集莖稈顏色分明的烏天麻、紅天麻和黃天麻各10個樣本，將塊莖清洗，切片存于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。所有樣品的標本憑證保存于陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院植物分子生物學(xué)實驗室。

1.2 方 法

1.2.1天麻DNA提取采用改良2×CTAB法提取天麻4個栽培居群120個樣本的基因組DNA，溶解在100 μL 0.1%TE緩沖液中，0 ℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用紫外分光光度計(NanoDrop 2000)檢測其純度，記錄DNA濃度和A260/A280吸光比值。各取10 μL 基因組DNA用濃度為1%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.2.2天麻的PCR擴增與聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測從本實驗室開發(fā)的20對天麻SSR引物[10]中選取條帶清晰，多態(tài)性高的7對引物(表1)對4個居群120個樣本進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，包括DNA模板50 ng，2×Mix(天根生物科技)10 μL，正反引物各50 ng，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)在PCR擴增儀(Bio-Rad S1000TM)上按以下程序運行：首先94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度下45 s，72 ℃下延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

完成PCR循環(huán)48 h內(nèi)，取2 μL PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓160V電泳14h。用NaOH銀染方法進行染色顯影。顯影完成之后，用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GEL DOCTM XR+)采集圖像并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與軟件分析將銀染過的聚丙烯酰凝膠拍照，使用Bio-Rad Quantity軟件對電泳圖進行條帶統(tǒng)計，采用人工讀帶的方式記錄主要帶型，忽略弱雜帶，在Excel 2016中構(gòu)建天麻SSR條帶數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用POPGENE Version1.32[11]計算各引物的等位基因數(shù)目(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、多態(tài)性信息含量[12](PIC)等參數(shù)，計算天麻變型和種群的遺傳多樣性，統(tǒng)計平均等位基因數(shù)目(A)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon多樣性指數(shù)(I)。使用GenALEX 6.1統(tǒng)計所有樣本的基因型組成，并計算所有個體的Simpson指數(shù)(D)，計算公式為：D=1-∑[ni(ni-1)/N(N-1)]，其中ni是指具有第i個基因型的個數(shù)。Simpson指數(shù)是測定種群克隆多樣性的重要指標，數(shù)值越高說明種群克隆多樣性越好。在本研究中借用Simpson指數(shù)來說明所有樣本中個體基因型的多樣性，如果群體中所有個體基因的基因型各不相同，則Simpson指數(shù)最大，即D=1；如果所有個體基因型都相同，則Simpson指數(shù)最小，即D=0。

此外，為了分析天麻種質(zhì)資源樣本的遺傳關(guān)系，應(yīng)用Structrue V2.3.4[13]軟件來確定所有樣本的聚類分組，并構(gòu)建了各樣本的遺傳關(guān)系圖[14]，使用GenALEX6.1對所有樣本進行主相關(guān)性(The Principal Coordinates Analysis, PCoA)分析，使用軟件ARLQEQUIN 3.0進行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA), 計算天麻物種及變型遺傳分化。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴增多態(tài)性與區(qū)分效率

本研究所提取的天麻樣本基因組DNA檢測結(jié)果顯示，天麻 DNA濃度均在45～360 ng/μL之間，A260/A280吸光比值均在1.6～2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳顯示，天麻 DNA長度均大于20 000 bp。提取到的天麻樣本總DNA純度和完整度高，能夠用于PCR擴增。

本研究所采用的7對天麻SSR引物均能對120份樣品進行擴增，效果良好(圖1)。表1顯示，SSR引物的等位基因數(shù)在5～7之間，共計45個；每個位點的等位基因數(shù)(Na)平均為6.428 6個，具有較好的多態(tài)性和通用性；期望雜合度(He)范圍為0.325 0～0.741 7，平均值為0.540 5；觀測雜合度(Ho)范圍為0.325 0～0.741 7，平均值為0.540 5(表1)。多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.626 2～0.823 5，平均值為0.759 5，而PIC值能夠反映引物對材料的區(qū)分能力，說明引物對材料具有較好的鑒別能力。

M.PUC-18 DNA marker; 1～10.YCB居群的10個個體M. PUC-18 DNA marker; 1-10. 10 samples of population YCB

表1本研究所用SSR引物的遺傳多樣性
Table 1 The genetic diversity of 7 SSR primer pairs used in this study

引物Primer等位基因數(shù)Number of alleles(Na)觀測雜合度Observed heterozygosity(Ho)期望雜合度Expected heterozygosity(He)多態(tài)信息量Polymorphism information content(PIC)GEBL0370.700 00.810 10.782 5GEBL0750.533 30.679 80.626 2GEBL1470.500 00.846 80.823 5GEBL2070.575 00.831 90.805 3GEBL2770.741 70.767 40.732 1GEBL2860.408 30.679 80.745 5GEBL3160.325 00.825 70.801 2平均 Mean6.428 60.540 50.792 30.759 5

2.2 天麻變型的遺傳多樣性與遺傳分化

對天麻各變型及種群的群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)，天麻在物種水平和變型水平有較高的遺傳多樣性(物種水平：A=6.428 6,H=0.789 0,I=1.682 9; 變型水平：A=2.666 6,H=0.523 9,I=0.812 3)，其中紅天麻遺傳多樣性明顯高于烏天麻與綠天麻(表2)。

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果(表3)顯示，38.18%的變異來自于變型間，17.68%的變異來自于變型內(nèi)種群間，而種群內(nèi)的變異占44.14%。這說明天麻種群間遺傳分化強烈(Fst=0.558 6)，天麻變型間也存在明顯的遺傳分化(Fct=0.381 8)。

表2 天麻種群的采樣地與遺傳多樣性Table 2 The sample locations and genetic diversities of G. elata populations

表3 天麻樣本的分子方差分析Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) of G. elata

2.3 天麻變型間SSR指紋圖譜的構(gòu)建與鑒定

利用7對天麻SSR引物構(gòu)建天麻SSR指紋圖譜(表4)并對指紋圖譜進行分析。在120份樣本中有106份樣本的基因型，絕大多數(shù)個體具有特有的基因型。僅有個別個體存在共享基因組型的情況，例如YLG10與YLG01共享一個基因型，ZTG10、ZTG09和ZTG08共享一個基因型，但這種共享基因型的情況僅僅發(fā)生在相同種群內(nèi)，變型間和種群間沒有共享基因型的情況。這表明本研究所用的7對天麻SSR引物在個體水平有著極高的鑒定效率。

表4 天麻樣本的SSR指紋圖譜Table 4 The SSR fingerprinting for G. elata samples

續(xù)表4 Continued Table 4

續(xù)表4 Continued Table 4

此圖為K=3時STRUCTURE 分組結(jié)果條形圖，圖中同一顏色表示同一變型Bar plots showing assignment probabilities from STRUCTURE analyses when K = 3, the same color in the figure represents the same variant

利用Structure軟件對120份樣本進行貝葉斯聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)K=3時，ΔK出現(xiàn)最大峰值，此時聚類圖將不同地域的相同天麻變型聚為一類，不同變型之間基因滲透現(xiàn)象較少(圖2)。此外，使用GenAlEx 6.1 軟件對樣本進行居群主相關(guān)性分析(圖3)，得到的結(jié)果與上述結(jié)果完全一致。這說明天麻不同變型在遺傳上的差異較為穩(wěn)定，本研究的結(jié)果和基于花葶顏色對不同變型進行分類的結(jié)果完全一致。這也表明，本研究所用的天麻SSR引物在變型水平也具有非常良好的鑒定效果，能有效區(qū)分天麻的不同變型。

3 討 論

目前許多中藥材均存在同名異物和同物異名的現(xiàn)象，而解決這類問題的方法則是進行有效準確的物種鑒定。目前常用的鑒定方法如形態(tài)學(xué)鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等都無法準確地對同屬同種等親緣關(guān)系較近的物種進行有效的鑒別。對于天麻而言，藥用部位為塊莖，更無法從形態(tài)學(xué)上進行準確的鑒定，而SSR分子標記技術(shù)有著信息量高、重復(fù)性好、呈共顯性遺傳等特點[15]成為天麻種質(zhì)資源鑒定的首選技術(shù)。本研究選用了7對天麻SSR引物對3種變型、12個種群共計120個樣本進行了檢測分析，并構(gòu)建了天麻變型間SSR指紋圖譜。

圖3 基于遺傳距離的天麻樣本主相關(guān)性分析Fig.3 The Principal Coordinates Analysis (PCoA) dendrogram for G. elata samples based on genetic distance

本研對120份樣品進行群體遺傳分析結(jié)果顯示，7對引物的平均觀測雜合度(Ho)為0.540 5，平均期望雜合度(He)為0.792 3。7對天麻SSR引物共獲得45個變異位點，平均每對引物6.43個，說明SSR引物變異豐富。并且7對天麻SSR引物多態(tài)性信息含量(PIC)較高,平均為0.759 7，表現(xiàn)出較高的鑒別材料樣本的能力，表明本研究所選用的7對SSR引物可用于天麻的種質(zhì)資源鑒定。

天麻為中國二級保護植物，野生資源資源稀少，亟需保護。本研究對所有樣本進行遺傳多樣性分析結(jié)果表明，天麻在物種水平上和變型水平上均有較高的遺傳多樣性(物種水平：A= 6.428 6，I= 1.682 9，H= 0.789 0；變型水平：A= 2.666 6，I= 0.523 9，H= 0.812 6)，進化潛能豐富。同時AMOVA分析表明，在所有天麻樣本中，主要遺傳變異(44.14%)來自于各個種群之內(nèi)，其次38.18%的遺傳變異來自于變型之間，并且變型間遺傳分化強烈(Fct=0.381 8)。隨著天麻產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，天麻的供需矛盾也日漸突出，盡管在全國范圍內(nèi)均有人工栽培，但野生天麻種質(zhì)資源依舊遭到嚴重破環(huán)，對天麻野生種質(zhì)資源的保護已刻不容緩。天麻在物種水平上具有高度遺傳多樣性，且遺傳分化強烈，因此首先應(yīng)該對現(xiàn)有野生天麻種群進行就地保護。其次，應(yīng)對野生天麻種質(zhì)資源進行廣泛的收集與保存，建立天麻種質(zhì)資源庫，確保收集天麻種質(zhì)資源中保留有該物種絕大部分的遺傳信息。

Structure聚類表明，當(dāng)K=3時，ΔK出現(xiàn)最大峰值，此時聚類圖將不同地域的相同天麻變型聚為一類，同一個產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同變型間基因滲透現(xiàn)象較少，這是由于在不同海拔上各個變型的分布比例不同，花期也存在一定差異，基因交流主要存在于同一變型間[16]。本研究對120份樣本進行居群主相關(guān)性分析(PCoA)，其結(jié)果與Structure聚類結(jié)果一致。最終根據(jù)PCoA圖以及Structure聚類顯示7對引物可以完全區(qū)分所有供試天麻變型材料，7對引物在變型水平上具有較高的鑒別能力，能用于今后對天麻種質(zhì)資源的分析與評價。

通過計算得出Simpson指數(shù)(D)為0.998，表明所有天麻樣本的基因型豐富度較高，在120個樣本中共檢測出了106個樣本的基因型組成不同，其余14個個體僅共享6個基因型，且共享基因型的個體均在相同的種群中。結(jié)果表明本研究所選用的7對SSR引物在個體水平有著較高的鑒定效率。

本研究運用現(xiàn)代分子生物學(xué)研究手段，利用開發(fā)的引物對天麻進行群體遺傳分析，并且建立適合天麻的種質(zhì)資源鑒定體系。研究結(jié)果可為后期天麻的良種選育與質(zhì)量控制提供技術(shù)方法與重要的科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果表明，天麻不同變型遺傳差異較大，因此根據(jù)天麻的花葶的顏色進行變型的分類是完全可靠的。本研究的結(jié)果也為天麻變型的分類提供了重要理論支撐。

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