招雪晴，苑兆和

(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037; 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 南京 210037)

石榴(PunicagranatumL.)屬于千屈菜科石榴屬[1]，是人類較早栽培的果樹之一，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等中亞地區(qū)，后向東傳入印度和中國，往西傳入地中海國家(土耳其、埃及、突尼斯、摩洛哥、西班牙等)，現(xiàn)在熱帶、亞熱帶、暖溫帶等地區(qū)都有廣泛栽培。石榴種質(zhì)資源豐富，全世界品種和類型超過1 000多個(gè)。2 000多年以前，石榴沿絲綢之路傳入中國，形成了豐富的遺傳多樣性[2-3]，許多不同花色、不同果色的品種成為石榴研究的重要材料。

色澤是果實(shí)外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，花色苷是決定果實(shí)色澤的主要物質(zhì)。目前，花色苷生物合成途徑已經(jīng)比較清楚(圖1)，花色苷與原花色素、黃酮醇等類黃酮物質(zhì)共享底物及上游代謝路徑，是類黃酮途徑的一個(gè)分支[4-6]?；ㄉ蘸铣傻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控在玉米(ZeamaysL.)、金魚草(AntirrhinummajusL.)、矮牽牛(Petuniahybrida)等模式植物上研究已比較深入[7]。目前，蘋果(MaluspumilaMill.)、葡萄(VitisviniferaL.)等果樹中花色苷合成調(diào)控研究已取得了重要研究進(jìn)展。蘋果中有多個(gè)MYB基因控制花色苷的合成，其中，MdMYBA[8]和MdMYB1[9]控制果皮著色，MdMYB10控制果肉的顏色[10]；白皮葡萄UFGT基因不表達(dá)，不能合成花色苷，但白皮葡萄和紅皮葡萄中UFGT基因的序列并未發(fā)生變化[11]，Kobayashi等[12]發(fā)現(xiàn)白皮葡萄之所以不能合成花色苷是由于控制UFGT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因發(fā)生了突變。目前，雖然也有石榴果實(shí)花色苷合成相關(guān)基因的分離與表達(dá)分析報(bào)道[13-16]，但花色苷合成基因在不同色澤品種間的表達(dá)差異未見有比較研究。由于基因表達(dá)的差異可能反映了不同的花色苷合成調(diào)控機(jī)制，本研究選取了2個(gè)不同紅色石榴品種為材料，對果皮花色苷合成相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，研究這些基因的表達(dá)特性及差異，分析它們在果實(shí)著色中可能的作用，以期為石榴果實(shí)紅色色澤調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究以2個(gè)石榴品種‘紅寶石’和‘墨石榴’為試驗(yàn)材料。‘墨石榴’俗稱‘紫石榴’，自幼果時(shí)果皮即呈紫紅色，具有極高的觀賞價(jià)值，是著名的觀花觀果品種；‘紅寶石’是‘大紅袍’的優(yōu)異芽變品種，果實(shí)成熟時(shí)呈大紅色[17]?！t寶石’、‘墨石榴’樣品采自山東省棗莊市嶧城區(qū)萬畝石榴園內(nèi)。分別在7月15日到9月13日采樣，共采樣7次，具體采樣時(shí)間為7月15、25日，8月4、14、24日和9月3、13日，每次各品種分別采8個(gè)果樣。為減少采樣誤差，采樣時(shí)選取長勢基本一致的植株，在樹冠的東、南、西、北四個(gè)方位均勻采摘。果實(shí)放在冰壺內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后，取果實(shí)外果皮混勻，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1果皮總花色苷的提取取樣品0.2 g，加入5 mL 0.1% HCl-甲醇溶液4 ℃浸提過夜后，10 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，利用島津UV-1601分光光度計(jì)分別測定530 nm、657 nm處的吸光值A(chǔ)530和A657，按照Mehrtens 等[18]的方法計(jì)算總花色苷含量(Q)：Q =(A530-0.25×A657)/樣品重量，每次均準(zhǔn)確稱量0.2 g樣品，以吸光度值(A530-0.25×A657)的變化表示果皮總花色苷含量的變化。重復(fù)3次。

CHS. 查尓酮合成酶; CHI. 查尓酮異構(gòu)酶; FNS.黃酮合成酶; F3H. 黃烷酮-3-羥化酶; FLS. 黃酮醇合成酶; DFR. 二氫黃酮醇-4-還原酶; ANS. 花青素合成酶; LDOX. 花色素雙加氧酶; UFGT. 類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶CHS. Chalcone synthase; CHI. Chalcone isomerase; FNS. Flavone synthase; F3H. Flavanone 3-hydroxylase; FLS. Flavonol synthase; DFR. Dihydroflavonol 4-reductase; ANS. Anthocyanidin synthase; LDOX. Leucoanthocyanidin dioxygenase; UFGT. UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 提取石榴果皮總RNA(RNAprep Pure Plant Kit，天根，北京)，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序參照Thermo scientific公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行。獲得的cDNA稀釋10倍后作為qRT-PCR模板。qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus試劑盒 (天根，北京)，在Bio-Rad iQ5 real time PCR systems完成。根據(jù)課題組前期克隆到的石榴果皮花色苷合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT的cDNA序列，利用Primer Premier software 6.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物(表1)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

qRT-PCR的反應(yīng)體系為 20.0 μL ，其中的SYBR Green為10 μL(SuperReal PreMix Plus, 天根，北京，中國)，上下游引物各0.6 μL (10 μmol·L-1)， cDNA為1 μL, RNase-free水為7.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 15 min； 95 ℃ 10 min； 58 ℃ 20 s； 72 ℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)；以PgActin(GenBank登錄號GU376750)為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法[19]，以‘紅寶石’7月15日樣品為對照，設(shè)定基因的表達(dá)量為1，得出各基因的相對表達(dá)量。同一時(shí)期果皮取樣3次，分別提取果皮RNA后反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行qRT -PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.3數(shù)據(jù)分析及相關(guān)性評價(jià)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Pearson相關(guān)系數(shù)評價(jià)花色苷含量與各基因表達(dá)量之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 總花色苷含量的變化

圖 2顯示， ‘紅寶石’石榴果實(shí)發(fā)育過程中，果皮色澤逐漸變紅，是一個(gè)典型的花色苷逐漸積累的過程。從圖3中可以看出，‘紅寶石’果皮中總花色苷含量隨著果實(shí)發(fā)育不斷增加，與果皮顏色不斷加深的變化(圖2)相一致；‘墨石榴’果皮顏色在整個(gè)發(fā)育期內(nèi)都呈紫紅色，沒有明顯色澤變化，但其果皮總花色苷含量有明顯的波動，初期時(shí)總花色苷含量較高，而后迅速下降，后期時(shí)花色苷含量則基本維持在較低水平(圖3)。在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過程中‘墨石榴’的花色苷含量水平明顯高于‘紅寶石’(圖3)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

圖2 不同采樣時(shí)期 ‘墨石榴’和‘紅寶石’的果皮色澤Fig.2 Fruit peel color of ‘Moshiliu’ and ‘Hongbaoshi’ pomegranate in different sampling dates

2.2 花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)特性

采用qRT-PCR方法，分別對花色苷合成相關(guān)的CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育過程中的相對表達(dá)量進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖4所示。

在‘紅寶石’石榴中，CHS、F3H、DFR、UFGT等4個(gè)基因在初期表達(dá)量逐漸升高，在8月4日時(shí)到達(dá)一個(gè)小高峰后迅速下降，而后又逐漸升高，在后期9月13日時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)高峰；CHI基因的表達(dá)高峰首先出現(xiàn)在7月25日，之后其轉(zhuǎn)錄水平下降，然后又不斷升高，后期到9月13日時(shí)又達(dá)到表達(dá)高峰，即CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT等5個(gè)基因有前期和后期2個(gè)表達(dá)高峰；而ANS的轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期內(nèi)逐漸增加，在9月13日到達(dá)表達(dá)高峰；在‘墨石榴’中，CHS、CHI、F3H、DFR、ANS5個(gè)基因一開始的表達(dá)量最高，而后出現(xiàn)下降，中后期的表達(dá)水平雖然有所升高，但仍不及初期時(shí)的水平，在果實(shí)發(fā)育后期(從9月3日到9月13日)，這5個(gè)基因的表達(dá)水平都出現(xiàn)了較大幅度的下降；UFGT基因在‘墨石榴’中的表達(dá)模式與其他幾個(gè)基因有差異，其轉(zhuǎn)錄水平先是不斷下降，然后又快速升高，到8月14日時(shí)出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)高峰，其后表達(dá)量又緩慢下降。

圖3 2個(gè)石榴品種在果實(shí)發(fā)育過程中總花色苷含量的動態(tài)變化Fig.3 Changes of total anthocyanins content in two pomegranate cultivars during fruit deuelopment

圖4 2個(gè)石榴品種在果實(shí)發(fā)育過程中各基因的相對表達(dá)量(均值±SD)Fig.4 Relative expression levels of anthocyanin genes in two pomegranate cultivars during fruit development (mean value±SD)

表2 基因表達(dá)量與總花色苷含量的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficient between total anthocyanins content and gene expression levels

結(jié)果顯示，參與花色苷合成的相關(guān)基因在2個(gè)紅色石榴品種中具有不同的表達(dá)模式?！t寶石’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6個(gè)基因的末期表達(dá)量明顯高于‘墨石榴’；‘墨石榴’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等5個(gè)基因的表達(dá)水平在初期即明顯高于‘紅寶石’，兩者完全不同的基因表達(dá)模式可能是2個(gè)石榴品種色澤差異的原因所在。

2.3 總花色苷含量與基因表達(dá)的相關(guān)性

對2個(gè)石榴品種果實(shí)發(fā)育期內(nèi)總花色苷含量與花色苷相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性評價(jià)。表2列出了表征相關(guān)性的Pearson相關(guān)系數(shù)。從中可以看出，在‘紅寶石’果實(shí)發(fā)育期內(nèi)，ANS基因的表達(dá)量與花色苷含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.850，呈顯著正相關(guān)；在‘墨石榴’中，CHS和ANS2個(gè)基因的表達(dá)水平與花色苷含量相關(guān)系數(shù)分別為0.809和0.800，均為顯著正相關(guān)。這表明ANS基因與‘紅寶石’石榴中花色苷合成關(guān)系密切，CHS和ANS2個(gè)基因與‘墨石榴’中花色苷合成聯(lián)系緊密。

3 討 論

花色苷是石榴果皮呈紅色的主要色素物質(zhì)[13,20]。花色苷含量差異是‘紅寶石’和‘墨石榴’2個(gè)品種色澤差異的物質(zhì)基礎(chǔ)?；ㄉ蘸铣上嚓P(guān)基因的表達(dá)直接決定了花色苷的積累。在‘紅寶石’著色的過程中，花色苷合成相關(guān)基因CHI、CHS、DFR、F3H、UFGT等都出現(xiàn)了早期和晚期2個(gè)表達(dá)高峰，類似基因表達(dá)模式在葡萄[21]、越橘(Vacciniummyrtillus)[22]、野蘋果(MalussylvestrisL.)[23]、桃(PrunuspersicaL.)[24]等果樹的花色苷合成中都有報(bào)道。進(jìn)一步對比后發(fā)現(xiàn)，‘紅寶石’中這些花色苷相關(guān)基因的表達(dá)模式與總花色苷含量逐漸累積的變化趨勢有很大不同。石榴果皮中含有大量的酚類物質(zhì)，花色苷、黃酮、黃酮醇、原花色素(縮合單寧)都經(jīng)由類黃酮途徑來完成，在合成過程中共用一些酶催化反應(yīng)。我們推測，在石榴果實(shí)色澤發(fā)育的早期，這些基因表達(dá)量的升高很可能主要參與催化合成黃酮類和原花色素等物質(zhì)，而后期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)高峰則主要是進(jìn)行花色苷的大量合成。例如，草莓(Fragaria×ananassaDuch.)中DFR基因在綠果期和花色苷積累初期有2個(gè)表達(dá)高峰，果實(shí)成熟期時(shí)的高表達(dá)與花色苷合成有關(guān)，而在早期的高表達(dá)則與縮合單寧的積累有關(guān)[25]。

在‘墨石榴’中，這些基因呈現(xiàn)出與‘紅寶石’不同的表達(dá)模式。除UFGT基因外，其他5個(gè)基因在初期的表達(dá)量很高，而中后期含量有所下降。這種表達(dá)模式與果皮總花色苷含量的變化模式有一定的相似性，這些基因很可能協(xié)同參與了‘墨石榴’果皮花色苷的合成。CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等基因早期的高位運(yùn)行，說明它們在轉(zhuǎn)錄和催化反應(yīng)中比較活躍，在發(fā)育初期就積累了大量底物用于花色苷的合成，這大概是‘墨石榴’果皮在早期就呈現(xiàn)紫紅色的原因所在。另外，UFGT是基因超家族，反應(yīng)底物廣泛，能夠催化花色苷、黃酮、黃酮醇等多種物質(zhì)的糖基化反應(yīng)[26]，因而，‘墨石榴’中UFGT基因很可能不僅僅負(fù)責(zé)花色苷合成，還同時(shí)參與了其他類黃酮物質(zhì)的催化反應(yīng)。

通過比較分析發(fā)現(xiàn)，‘紅寶石’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6個(gè)基因的末期表達(dá)量明顯高于‘墨石榴’；‘墨石榴’的CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等基因初期表達(dá)水平明顯高于‘紅寶石’，說明這些花色苷合成基因在初期和末期的表達(dá)水平差異與石榴果皮色澤差異密切相關(guān)?！t寶石’和‘墨石榴’的著色模式完全不同，基因表達(dá)差異表明兩者可能具有不同的花色苷調(diào)控機(jī)制。

目前在許多物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了花色苷合成的關(guān)鍵基因。在蘋果[27-29]、楊梅(Myricarubra)[30]、荔枝(LitchichinensisSonn.)[31]、菊花(Dendranthemagrandiflorum)[32]等的研究中發(fā)現(xiàn)，DFR和UFGT的基因表達(dá)與花色苷含量的積累一致；DFR和ANS可能是云南紅梨(Pyruspyrifolia)‘早白蜜’果皮著色的限制因子[33]。而UFGT基因的表達(dá)與否則決定了紅葡萄與白葡萄不同的表型[11]；CHS與DFR是桃花色苷合成中的關(guān)鍵基因[24]。本研究中的相關(guān)性分析表明，ANS基因在‘紅寶石’石榴花色苷合成過程中起重要作用，ANS和CHS基因與‘墨石榴’花色苷合成關(guān)系也很密切。Ben-Simhon等[13]對2個(gè)不同紅石榴類型進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，主要花色苷含量與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WD40、MYB和結(jié)構(gòu)基因DFR、ANS的表達(dá)具有較高的相關(guān)性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子很可能通過特異調(diào)控DFR和ANS基因來控制矢車菊素(主要花色苷)的合成；最近的研究發(fā)現(xiàn)，ANS基因編碼區(qū)變異導(dǎo)致白皮石榴花色苷合成受阻[34]，這些結(jié)果表明ANS基因是石榴花色苷合成的關(guān)鍵。本研究雖未發(fā)現(xiàn)DFR基因與花色苷合成之間的相關(guān)性聯(lián)系，但結(jié)果也表明了ANS基因在石榴花色苷合成中的重要作用。

選育優(yōu)質(zhì)的紅色石榴品種是石榴育種的一個(gè)重要目標(biāo)，深入研究石榴花色苷合成調(diào)控機(jī)制是育種的理論基礎(chǔ)。本研究選擇2個(gè)果皮著色有突出差異的品種為研究試材，分析了兩者花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)差異。由于不同品種間遺傳背景的差異，ANS和CHS是否為2個(gè)石榴品種花色苷合成的關(guān)鍵基因，以及它們是否與花色苷合成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子存在互作關(guān)系，還需要進(jìn)一步功能驗(yàn)證研究。

4 結(jié) 論

‘紅寶石’和‘墨石榴’2個(gè)石榴品種表現(xiàn)出不同的花色苷積累規(guī)律，‘紅寶石’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6個(gè)基因的末期表達(dá)量明顯高于‘墨石榴’，‘墨石榴’的CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等基因初期表達(dá)水平明顯高于‘紅寶石’，這些花色苷合成基因表達(dá)水平在初期和末期的顯著差異可能是造成2個(gè)品種著色差異的原因。ANS基因是‘紅寶石’花色苷合成中的關(guān)鍵，而CHS和ANS基因在‘墨石榴’花色苷合成中扮演重要角色。

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