羅嫄 董瑞（成都市食品藥品檢驗研究院 四川 成都 610045）

結(jié)核病是青年人容易發(fā)生的一種慢性和緩發(fā)的傳染病，而利福平膠囊（Ⅱ）即適用于結(jié)核病、腦膜炎、軍團菌病、結(jié)核性腦膜炎、麻風(fēng)病等人群使用。雖然現(xiàn)在環(huán)境衛(wèi)生條件提高，醫(yī)療技術(shù)發(fā)達，本制劑的使用范圍和受眾都有縮小，但其治療意義依然存在。利福平膠囊（Ⅱ）目前沒有被各國藥典收載，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)也沒有有關(guān)物質(zhì)測定項，故本文結(jié)合《中國藥典》2010版附錄藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則以及《中國藥典》2010版利福平項下相關(guān)資料，對利福平膠囊（Ⅱ）的有關(guān)物質(zhì)進行了方法學(xué)研究。

1.儀器與試藥

Waters 2695-2489高效液相色譜儀：四元泵，在線脫氣，柱溫箱，自動進樣器，紫外檢測器；Millipore超純水發(fā)生器；梅特勒電子天平。

醌式利福平對照品（中國藥品生物制品檢定所），N-氧化利福平對照品（中國藥品生物制品檢定所），3-甲酰利福霉素SV對照品（中國藥品生物制品檢定所），利福平對照品（中國藥品生物制品檢定所）。利福平膠囊（Ⅱ）（A藥廠，編號：1、2、3；B藥廠，編號4、5、6）。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純。

2.色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫C8（4.6×250mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.075 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-1.0 mol·L-1枸櫞酸溶液；流速：1.0ml·min-1；檢測波長：254nm；柱溫：35℃；進樣量：10μl。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

取3.3項下系統(tǒng)適用性溶液進樣，各峰的分離度符合要求。

3.溶液的制備

3.1 供試品溶液的制備

精密稱取供試品約250mg，置50ml量瓶中，加乙腈約25ml，溫水浴中振搖使溶解，放冷后用乙腈稀釋至刻度，搖勻，靜置；精密吸取上清液用乙腈稀釋并定量制成1mg·ml-1的溶液，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取利福平對照品適量，加乙腈溶解并稀釋成10μg·ml-1的溶液作為對照品溶液（1）；分別精密稱取醌式利福平對照品、N-氧化利福平對照品、3-甲酰利福霉素SV對照品適量，加乙腈溶解并稀釋成10μg·ml-1的各雜質(zhì)對照品溶液。

3.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備

稱取利福平對照品、醌式利福平對照品、N-氧化利福平對照品、3-甲酰利福霉素SV對照品適量，加乙腈溶解制成0.04mg·ml-1的溶液，即得。

4.方法與結(jié)果

4.1 專屬性試驗

對供試品進行了酸、堿、熱、氧化和光照等破壞試驗，結(jié)果證明該色譜條件對上述破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物能有效分離，色譜條件能滿足利福平膠囊（Ⅱ）有關(guān)物質(zhì)的測定。

4.2 線性和范圍

分別取醌式利福平對照品、N-氧化利福平對照品、3-甲酰利福霉素SV對照品適量，加乙腈溶解并稀釋成1、2.5、5、10、20、30μg·ml-1的各雜質(zhì)對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定峰面積并進行計算，r均為0.9999，可見這三種特殊雜質(zhì)在1～30μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.3 精密度

取3.2項下各雜質(zhì)對照品溶液連續(xù)進樣，計算精密度，結(jié)果表明各雜質(zhì)的精密度均良好。

4.4 回收率試驗

分別稱取醌式利福平對照品、N-氧化利福平對照品、3-甲酰利福霉素SV對照品適量，加乙腈溶解并制成1mg·ml-1的各雜質(zhì)對照品溶液。另每個特殊雜質(zhì)回收試驗稱取供試品9份，置100ml量瓶中，分為三組，每組依次加入各雜質(zhì)對照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率，各雜質(zhì)回收率均在96%以上。

4.5 耐用性試驗

換用不同的色譜柱：資生堂C8（4.6×250mm，5μm）進行有關(guān)物質(zhì)檢測，與原檢測結(jié)果比較。實驗結(jié)果表明，雜質(zhì)峰分離度良好，雜質(zhì)含量相差較小，本法耐用性良好。

4.6 樣品測定

將兩廠家樣品進行測定，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩個廠家不同批號制劑中醌式利福平含量相近，N-氧化利福平和3-甲酰利福霉素SV含量相差較大，其余各雜質(zhì)總量含量較為接近。

表1 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%）Tab.1 The results of related substance（%）

5.討論

5.1 溶劑篩選

利福平溶于有機溶劑，將溶劑分別換為甲醇和乙腈進樣，結(jié)果比較接近，但試驗中發(fā)現(xiàn)用甲醇溶解的樣品放置后會有析出現(xiàn)象，故選用乙腈做為溶解介質(zhì)。

5.2 前處理方法的選擇

因供試品為油性基質(zhì)熱溶解后灌裝冷卻成形，膠囊內(nèi)容物為凝固的固體，且較硬，稱樣前需將其搗碎。若稱取的樣品直接超聲處理，碎塊的溶解性并不會隨超聲時間有所提高（曾試驗超聲30分鐘以上，結(jié)果仍不理想），這樣會影響成分的溶出進而影響測定結(jié)果。經(jīng)試驗將樣品加入溶劑后置溫水浴中振搖能很快溶解基質(zhì)，故選擇微微加熱的方式來處理樣品。

5.3 特殊雜質(zhì)的對照品溶液一定要分開配制進樣，因為如果全部混合到一份對照溶液中，它們會相互反應(yīng)產(chǎn)生新的雜質(zhì)，影響定量結(jié)果。

6.結(jié)語

本文建立了液相色譜法測定利福平膠囊（Ⅱ）有關(guān)物質(zhì)的方法。在該色譜條件下可以定量測定主要雜質(zhì)并控制其他雜質(zhì)總量，雜質(zhì)和主峰分離度好，可以用于該制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測。

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