李云仙 李永梅 楊發(fā)忠 李 靖

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224;3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；4. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

植物體進(jìn)化了一系列防御機(jī)制來防止昆蟲的取食，這些機(jī)制主要分為兩類：組成型防御反應(yīng)和誘導(dǎo)型防御反應(yīng)，組成型防御反應(yīng)是植物固有的防御反應(yīng)，具有特異性，以儲存化合物、結(jié)合化合物或活化化合物前體的形式存在，這些物質(zhì)都很容易受傷害誘導(dǎo)激發(fā)，迄今為止，大多數(shù)的防御反應(yīng)都是組成型的防御反應(yīng)。誘導(dǎo)型防御反應(yīng)僅發(fā)生在植物被傷害之后，例如，當(dāng)植物遭遇食草動物侵襲時，體內(nèi)茉莉酸水平迅速升高，促使植物中許多參與反應(yīng)的蛋白質(zhì)合成[1-3]。植物受病原物侵染后，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量會發(fā)生變化[4]，植物病原菌的入侵能引起寄主植物產(chǎn)生一系列的生理生化和代謝變化，如一些專性寄生真菌侵染后常會使寄主植物葉綠體的非環(huán)式電子傳遞受到抑制[5]。中國月季感染白粉菌后,體內(nèi)蛋白質(zhì)、糖的含量以及礦質(zhì)元素的種類和含量均發(fā)生了變化[6-7]。在侵染后期，許多病原物可引起寄主植物的質(zhì)膜透性改變，葉表的保護(hù)組織受到破壞，導(dǎo)致水分大量流失，造成寄主植物局部壞死，尤其是寄主在感染銹病后，表皮被成熟的銹孢子突破甚至撕裂，表皮層和角質(zhì)層受到了損害，失去了保護(hù)葉片的作用，蒸騰作用會大大加強(qiáng)[8]，使植物的生長發(fā)育受到影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染對昆蟲存在有利或者不利影響，例如象蟲 (Apiononopordi) 在銹菌 (Pucciniapunctiformis) 感染的田薊 (Cirsiumarvense) 上，比在健康田薊上有更高的存活率[9]；甜菜夜蛾 (Spodopteraexigua) 對感染白粉病 (Sphaerothecapannosa) 的中國月季 (Rosachinensis) 取食和產(chǎn)卵量均明顯下降[10]。目前，對于病蟲之間通過寄主植物的介導(dǎo)作用而進(jìn)行的間接相互作用的研究很少見報道，特別是對這種通過病原真菌毒素誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生對植食性昆蟲抗性的機(jī)理的研究還未見報道。

鏈格孢菌 (Alternariatenuissima) 屬真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目，是一類自然界中普遍存在的植物致病菌，其致病的主要機(jī)理是通過產(chǎn)生多種毒素，造成被侵染植物組織的病理反應(yīng)和傷害，鏈格孢菌毒素能破壞質(zhì)膜、葉綠體、以及線粒體的結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞正常代謝[11]。鏈格孢菌 (Alternariasp.) 粗毒素處理中國月季對月季長管蚜有十分明顯的抑制作用[12-13]。毒素處理后的中國月季對月季長管蚜表現(xiàn)出明顯的趨避作用的機(jī)理目前仍然不清楚。在病蟲互作關(guān)系的研究中，寄主植物介導(dǎo)的間接病蟲互作關(guān)系的影響機(jī)理仍不清楚，需要對寄主植物生理生化方面進(jìn)行進(jìn)一步研究,本實(shí)驗(yàn)對進(jìn)一步探討寄主、病害、蟲害三者互作機(jī)理具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品采自云南省昆明市呈貢、昆陽等月季種植基地，選取無病蟲害生長基本一致的植株于大棚中培養(yǎng)50 d后備用；鏈格孢菌是從斗南中國月季種植基地的月季上按照常規(guī)方法分離純化得到。儀器及試劑主要有:自動凱氏定氮儀 (瑞典FOSSTECATOR公司，2300型)；樣品消化器 (瑞典FOSSTECATOR公司，2300型)；鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)儲備液；40%氫氧化鈉溶液；濃硫酸 (分析純)；高純氬氣 (99.999%)；微波消解儀 (美國CEM，Mars5)；VISFA-MPX型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 (美國VARIAN公司)；可見分光光度計；各種礦質(zhì)元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 (國家鋼鐵材料測試中心)，濃度為1 000 μg/mL；硝酸、雙氧水為優(yōu)級純；超純水；玻璃儀器均經(jīng)10%HNO3浸泡過夜，用超純水清洗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鏈格孢菌粗毒素的提取及細(xì)交鏈孢菌酮酸的分離制備

將分離純化的鏈格孢菌株種在PDA培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)至菌落鋪滿平板。3平板為一組,將菌株連同培養(yǎng)基用刀片劃成1 cm × 1 cm大小的小塊放置于錐形瓶內(nèi)，向錐形瓶內(nèi)倒入有機(jī)提取液 (V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=80∶15∶5)，使提取液剛好沒過菌株和培養(yǎng)基。重復(fù)提取3次，合并提取液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用4 mL甲醇將固體萃取物溶解，裝在5 mL凍存管中，4 ℃保存。

提取到的粗毒素經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)樣到HPLC中進(jìn)行分析制備，流動相為100%乙腈，流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長280 nm。當(dāng)目標(biāo)峰出現(xiàn)時，收集流出物，通過多次收集目標(biāo)組分的洗脫液，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后，就獲得了高濃縮的洗脫液，合并濃縮后的洗脫液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將獲得的TeA用高效液相色譜再次分析，與標(biāo)準(zhǔn)品對比驗(yàn)證所得目標(biāo)產(chǎn)物是否一致。

1.2.2毒素細(xì)交鏈孢菌酮酸處理月季

用一定濃度的細(xì)交鏈孢菌酮酸 (TeA) 溶液均勻噴灑經(jīng)溫室大棚培養(yǎng)的無病蟲害月季 (每天噴灑1次)，選擇月季植株中間的1株復(fù)葉噴灑，位于這株復(fù)葉以上和以下的復(fù)葉不做處理，測定2, 6, 10, 14, 20 d后葉片中蛋白質(zhì)、糖、水分和礦質(zhì)元素的含量。以相應(yīng)健康植株葉片作為對照。

1.3 測定方法

1.3.1葉片蛋白質(zhì)含量的測定

健康和TeA處理后的中國月季葉片洗凈烘干粉碎后裝袋備用。稱取0.1 g樣品于洗凈干燥的消化管內(nèi)，每個試樣做3個平行對照，稱取配制好的m(K2SO4)∶m(CuSO4)比例為5∶1的催化劑，吸取濃硫酸10 mL于消化管中，將加好試劑的消化管放到消化爐上預(yù)熱30 min (200 ℃)，消化溫度為420 ℃，消化至反應(yīng)液呈透明藍(lán)綠色,消化時間為1.5 h左右，取出冷卻15～20 min，將消化管放入2300型全自動凱氏定氮儀，關(guān)上安全門，儀器自動進(jìn)行蒸餾、滴定、計算最后記錄結(jié)果。

1.3.2葉片可溶性糖含量的測定

可溶性糖含量的測定用葸酮比色法，測定步驟如下。

1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：葡萄糖在80 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，精確稱取2.000 0 g，加蒸餾水溶解，并定容至1 L，4 ℃保存。使用時稀釋10倍。得到含糖量為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋成一系列0～100 μg/mL的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入7支具塞試管中，分別吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，各加入5 mL蒽酮試劑，混勻，沸水浴10 min，冷卻，用分光光度計測定625 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2) 樣品中可溶性糖的提?。悍Q取樣品0.5 g左右，剪碎研磨至勻漿，倒入三角瓶中。加入10 mL 80%乙醇；80 ℃水浴20 min，不斷攪拌，冷卻；4 000 r/min離心5 min，殘?jiān)屑? mL 80%乙醇。重復(fù)在80 ℃水浴中提取2次，合并上清液；加入10 mg活性炭，80 ℃水浴15 min，過濾，定容至25 mL，取0.2 mL樣品提取液；加入0.8 mL蒸餾水，混合；再加入5 mL蒽酮試劑，小心混合，沸水浴10 min，冷卻。用分光光度計測定625 nm處的吸光度的值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上的方程得到提取液中糖含量。

1.3.3葉片水分的測定

水分含量測定參考[14]的方法稍作改動，采用烘箱烘干的方法進(jìn)行測定。把采集到的健康和毒素TeA處理后的中國月季葉片洗干凈然后晾干，精密稱取一定量的新鮮葉片，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，根據(jù)失去水分的質(zhì)量計算出葉片的含水率。健康和毒素TeA處理后的葉片各平行測定5次，取平均值。

1.3.4葉片礦質(zhì)元素的測定

1) 樣品消解。采集毒素處理后的月季葉片和健康月季葉片，于烘箱中80 ℃烘干，烘干后的樣品取出用研缽研碎，然后分別精確稱取0.2～0.3 g樣品倒入消解罐中，精確到0.1 mg，依次加入5 mL濃硝酸，2 mL雙氧水，然后把消解罐置于微波消解儀中。按表1程序進(jìn)行消解，消解完成后待溫度冷卻至室溫，將消解罐中的液體轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用5%硝酸定容。平行測定3次并做空白試驗(yàn)[15]。

2) 分析譜線的選擇。為了避免待測礦質(zhì)元素之間相互影響和干擾譜線，每個元素均選取2～3條特征譜線進(jìn)行測定，綜合強(qiáng)度分析、干擾情況、穩(wěn)定性等因素，選擇干擾比較小、精密度比較高的適合待測樣品的分析線作為儀器的工作分析譜線。

3) 工作曲線的建立。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)空白溶液和不同濃度的各種礦質(zhì)元素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入電感耦合等離子體光譜儀 (ICP-OES) 中，在選定的儀器參數(shù)下，用標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的溶液進(jìn)樣5次，以平均吸收強(qiáng)度對各元素濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并獲得相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不小于0.999。

4) 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。各待測元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定的量分別加入到實(shí)驗(yàn)樣品中，按消解樣品的方法進(jìn)行消解，按照樣品測定方法重復(fù)測定5次。加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量 × 100%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)/計算結(jié)果的算術(shù)平均值 (X)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒素處理后月季葉片中蛋白質(zhì)含量變化

毒素處理月季葉片蛋白質(zhì)含量的時間和空間變化見圖1。

圖1毒素處理月季葉片蛋白質(zhì)含量的時間和空間變化
Fig.1 Temporal and spatial changes of protein content in leaves ofR.chinensiswith toxin

從圖1可看出，與健康葉片相比，處理2 d后葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量已經(jīng)下降，但是感病6 d后，葉片中蛋白質(zhì)含量突然增高，后隨處理時間延長而進(jìn)一步降低，從208.41 mg/g降低至145.09 mg/g，差異達(dá)顯著水平 (P< 0.05)。毒素處理月季對其葉片中蛋白質(zhì)含量存在一定的空間效應(yīng)，而且對上方空間影響大于下方，處理20 d時，上方月季葉片中蛋白質(zhì)含量下降比下方月季葉片中蛋白質(zhì)含量大?？傮w來看，蛋白質(zhì)的含量隨著處理時間的延長而逐漸降低，3個部位的蛋白質(zhì)含量都與處理時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.2 毒素處理后月季葉片中可溶性糖含量變化

毒素處理前后月季葉片中可溶性糖含量的時間和空間變化變化見圖2。

圖2毒素處理前后月季葉片中可溶性糖含量
的時間和空間變化變化
Fig.2 Temporal and spatial changes of soluble sugar content in leaves ofR.chinensistreated with toxin

由圖2可以看出，隨TeA處理時間的增加，葉片內(nèi)可溶性糖含量呈下降趨勢，呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。且處理部位可溶性糖下降量顯著高于處理部位以上和以下的葉片，3個部位可溶性糖含量均下降，說明TeA處理對月季葉片可溶性糖含量的影響存在時空效應(yīng)。

2.3 毒素處理后月季葉片中水分含量變化

毒素處理月季葉片水分含量的時間和空間變化見圖3。

圖3毒素處理月季葉片水分含量的時間和空間變化
Fig.3 Temporal and spatial changes of water content in leaves ofR.chinensiswith toxin

從圖3可知，鏈格孢菌毒素對月季葉片水分含量的影響很大,毒素處理2 d后，月季葉片含水量開始明顯下降，并隨處理時間的增加而顯著降低，到20 d時，與健康葉片相比,水分含量下降8.04%左右。同時,毒素處理月季對其葉片中水分含量存在明顯的空間效應(yīng)，位于處理葉片上方和下方的葉片含水量也隨之下降，處理時間在10 d以前，與處理時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。10 d以后，水分含量幾乎不再變化。

2.4 毒素處理前后月季中礦質(zhì)元素含量的變化

用電感耦合等離子體光譜儀 (ICP-OES) 測定了鏈格孢菌毒素TeA處理中國月季植株后，月季葉片中礦質(zhì)元素的含量，測定結(jié)果見表1～2。

由表1～2可知，健康中國月季葉片和用鏈格孢菌毒素處理后的月季葉片中均檢測出17種元素，Ca、Mg、K、S、P在2種葉片中含量都很高，與健康葉片對比，Ca、Mg、K、S、P、Sn、Zn在毒素處理后的葉片中含量均明顯下降 (P< 0.05)，且下降量隨處理時間的增加而增大。Al、B、Cu、Mn、Na、Si、Sr 7種元素在毒素處理后的葉片內(nèi)含量高于健康葉片，在處理6 d后，B、Cu、Mn、Na、Si、Sr 6種元素含量顯著高于健康葉片 (P< 0.05)；由此可以看出，中國月季用鏈格孢菌毒素 (TeA) 處理后多種礦質(zhì)元素含量發(fā)生變化，10種元素含量降低，有7種元素含量升高，含量降低的礦質(zhì)元素主要是一些對植物生命代謝起著重要作用的元素，例如Ca、Mg、K、S、P，下降幅度比較大。Al、B、Cu、Mn、Na、Si、Sr在毒素處理后的葉片中含量升高，其中Na含量增大較多，TeA處理后的第2天，Na含量由53.37 μg/g上升1 015.42 μg/g，增加了將近20倍，之后有所下降，但仍然比對照高10倍以上；Ba、Be、Ca、Mg、K、Mn、Fe等元素變化較復(fù)雜，呈現(xiàn)先降低后又升高之后又降低的趨勢；Al和Si含量在第20天最高，分別為46.19 μg/g和203.21 μg/g，Mn元素在處理2天后，含量降低，之后又直線升高；位于處理部位上方和下方的葉片中礦質(zhì)元素的變化和鏈格孢菌毒素 (TeA) 處理部位葉片中礦質(zhì)元素含量的變化一致，說明TeA處理對月季葉片礦質(zhì)元素含量的變化存在一定的空間效應(yīng)。與處理部位葉片中礦質(zhì)元素含量不同之處有：Al元素含量在第10天達(dá)到最高，之后又下降；Na元素含量增高的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于處理部位，Mn元素含量增大量比處理部位高。礦質(zhì)元素的這種變化趨勢可能與植物抗蟲性有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

表1 鏈格孢菌毒素TeA處理中國月季后葉片大量元素時間和空間的含量變化 (μg/g)Table 1 Temporal and spatial changes of major elements contents in leaves of R.chinensis leaves treated with TeA

注：處理部位為 “中”，上、下表示位于處理部位以上和以下的葉片，0、2、6、10、14、20表示處理時間，0為健康葉片 (對照)。

表2 鏈格孢菌毒素TeA處理中國月季后葉片微量元素時間和空間的含量變化 (μg/g)Table 2 Temporal and spatial changes of microelements contents in leaves of R.chinensis treated with TeA

續(xù)表2

注：處理部位為 “中”，上、下表示位于處理部位以上和以下的葉片，0、2、6、10、14、20表示處理時間，0為健康葉片 (對照)。

3 結(jié)論與討論

中國月季用鏈格孢菌毒素TeA處理后，葉片內(nèi)蛋白質(zhì)、可溶性糖、水分含量與健康葉片相比均明顯下降,并且鏈格孢菌毒素TeA侵染中國月季葉片后，三者都存在時間和空間效應(yīng),隨處理天數(shù)的增加,水分和可溶性糖含量下降程度增大,蛋白質(zhì)含量變化則呈現(xiàn)出較復(fù)雜的一個變化趨勢，在處理6 d后月季葉片蛋白質(zhì)含量高于健康葉片，之后又明顯下降，這個現(xiàn)象可能是因?yàn)椋录臼懿?/p>

原菌侵染后,體內(nèi)茉莉酸水平迅速升高，促使植物中許多參與反應(yīng)的蛋白質(zhì)合成,是植物主動防御的一個表現(xiàn)，之后，蛋白質(zhì)含量顯著下降，可能是毒素進(jìn)入葉片影響質(zhì)膜通透性，造成葉片細(xì)胞程序性死亡，進(jìn)而也導(dǎo)致葉片水分喪失，水分含量降低。Ca、Mg、K等礦質(zhì)元素對昆蟲正常的生長發(fā)育起著關(guān)鍵的作用，與健康葉片相比，TeA處理后的月季葉片中，Ca、Mg、K、S、P、Zn這幾種元素含量顯著降低，表明鏈格孢菌毒素對月季生長發(fā)育、生理代謝有較大影響，這可能是毒素處理月季葉片后影響月季長管蚜搜尋寄主及生長發(fā)育的重要原因之一。月季葉片中Al、B、Cu、Mn、Na、Si、Sr 7種元素在毒素處理后含量大幅增高，這可能與植物抗病性有關(guān)，有研究表明：病原菌侵染中國月季后，月季體內(nèi)Al、B、Cu、Mn元素含量增高；月季外施礦質(zhì)元素后提高了月季對長管蚜的抗性，礦質(zhì)元素通過植物介導(dǎo)影響蚜蟲與月季生理代謝。Al、Cu 2種元素均為對昆蟲毒性很強(qiáng)，所以可能這2種元素含量的變化與月季長管蚜對鏈格孢菌毒素處理后的月季葉片取食量減少有關(guān)，這2種元素的量增加不利于昆蟲的取食。為什么鏈格孢菌毒素TeA處理中國月季后Al、Cu元素含量會增大，以及這兩種元素在植物抗病性方面是否有什么作用，這些問題值得進(jìn)一步深入研究。這些是值得深入研究的問題。

目前，對于植物病原菌危害對寄主植物營養(yǎng)成分影響的研究很少,其中也有一些研究表明,植物被病原菌侵染后各營養(yǎng)成分發(fā)生了變化。比如,白粉菌浸染中國月季后,中國月季葉片中可溶性蛋白質(zhì)和總糖含量都明顯下降[6]，Ca、Mg、K等元素含量也顯著下降，Al、Cu、B 、Mn含量增高[7]，這些研究結(jié)果與本研究得出的結(jié)論基本一致,這說明即使是不同種類的病原菌，其侵染對寄主植物營養(yǎng)成分含量造成的影響規(guī)律也是類似的。

本研究試圖從植物營養(yǎng)成分變化的角度闡明鏈格孢菌毒素TeA誘導(dǎo)月季對月季長管蚜產(chǎn)生不利影響的機(jī)理。結(jié)果顯示，TeA對中國月季葉片內(nèi)水分、蛋白質(zhì)、可溶性糖和重要礦質(zhì)元素的含量均顯著下降，表明營養(yǎng)成分含量變化是月季長管蚜避免取食的重要原因之一。目前關(guān)于植物介導(dǎo)產(chǎn)生的病蟲互作關(guān)系的研究缺乏寄主植物生理生化變化方面的直接證據(jù),本實(shí)驗(yàn)對進(jìn)一步研究病害對寄主植物防御蟲害的機(jī)理具有重要意義。

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