簡(jiǎn)功輝 陳俊龍 黃永松 李冬春 王 勇△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

深靜脈血栓（DVT）是由于血液在管腔內(nèi)的異常凝集出現(xiàn)的以肢體腫脹、甚則局部青紫、疼痛難忍為代表的深靜脈功能不全疾病。研究表明，炎癥與DVT聯(lián)系緊密［1］，其誘導(dǎo)并加重血栓形成近年來已經(jīng)達(dá)成國內(nèi)外共識(shí)；同時(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為多基因表達(dá)的調(diào)控點(diǎn)，廣泛參與機(jī)體炎癥反應(yīng)［2］，是近年來研究的熱點(diǎn)，其作為炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)可能與深靜脈血栓的形成存在某種橋梁關(guān)系。消栓飲是本文通信作者湖南省中醫(yī)院王勇教授通過多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成。本研究擬通過消栓飲作用于創(chuàng)傷性深靜脈血栓兔靜脈壁NF-κB p65 mRNA、IKBa mRNA 及血清 NF-κB 的變化，判斷以NF-κB信號(hào)為中心的炎癥過程中深靜脈血栓的轉(zhuǎn)歸，進(jìn)一步明確消栓飲防治DVT的作用機(jī)理?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康的新西蘭大白兔45只，體質(zhì)量 2.0～3.0 kg，雄性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（湘）2013-0005。質(zhì)量合格證：43608300000256，由湖南太平生物科技有限公司提供。

1.2 試藥與儀器 消栓飲：黃芪50 g，丹參30 g，大腹皮 15 g，白芍 30 g，歸尾 10 g，川牛膝 15 g，茯苓 10 g，澤瀉 10 g，枳殼 10 g，桂枝 6 g，豬苓 10 g，陳皮 10 g，甘草6 g。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一制成120 mL濃縮藥液 （生藥質(zhì)量濃度為1.77 g/mL），封包備用；低分子肝素鈉注射液 （活多史，國藥準(zhǔn)字H20053199，昆明積大制藥股份公司，4250 IUaXA 0.4 mL，批號(hào)：161008）；戊巴比妥鈉（上海哈靈生物科技有限公司，規(guī)格 5 g/瓶）。Trizol試劑（ambion，15596026）、SYBR Green PCR 試劑盒 （KAPA Biosystems，KM4101）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TAKARA，639505）、RNase I（Fermentas，AM2295）、DEPC 處理水（bioswamp，PAB180005）。 熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）、水平電泳設(shè)備（美國BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（美國 BIO-RAD）、PCR 儀（美國 BIO-RAD）、顯微鏡（OLYMPUS 公司）、彩色病理圖像分析儀（OLYMPUS公司）、醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 造模與分組 參照張春強(qiáng)［3］的造模方法，采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）沿耳緣靜脈注射麻醉后左腹股溝內(nèi)側(cè)沿大腿股靜脈方向縱形切開3 cm的傷口，逐層分離顯露股靜脈血管及其屬支，再使用12.5 mm全齒蚊氏鉗選擇股靜脈上相隔5 mm距離的3處不同位置鉗夾（一格力量）各3 s，鉗夾后，用3-0號(hào)絲線逐層閉合傷口，接著行髖人字石膏固定（傷口處保持5 cm開窗）；而假手術(shù)組選擇相同位置及長度切開顯露股靜脈，但不鉗夾，按相同操作關(guān)閉傷口及保持石膏外固定。術(shù)后24 h拆除髖人字石膏，按原切口暴露后肉眼觀察，同時(shí)配合HE染色法共同判定血栓形成。隨機(jī)選取27只經(jīng)造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法分為消栓飲組（A 組）、低分子肝素鈉組（B 組）、模型組（C 組）3 組，剩余18只均分為假手術(shù)組（D組）及空白對(duì)照組（E組）；分組完畢后，測(cè)量發(fā)現(xiàn)各組大白兔體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示組間均衡性好。

1.4 干預(yù)方法 通過人兔等效劑量換算，得出A組大白兔消栓飲灌胃量為9.9 g/（kg·d），每日2次；B組大白兔予以腹壁皮下注射低分子肝素鈉，每支用40 mL 5%葡萄糖溶液稀釋，40 IU/（kg·次），每日 1 次；C、D、E組予以等劑量0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日2次。各組于第1、3、7天第2次灌胃4 h后每次隨機(jī)選取3只大白兔進(jìn)行股靜脈取樣及腹主動(dòng)脈采血。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）將腹主動(dòng)脈血保存于EDTA管，靜置、離心后，采用ELISA檢測(cè)血清NF-κB值。2）采用 RT-PCR法檢測(cè)股靜脈中 NF-κB p65 mRNA、IKBa mRNA相對(duì)表達(dá)量，HE染色進(jìn)行組織學(xué)分析；具體方法如下，進(jìn)行股靜脈樣本采集后，近端0.5 cm進(jìn)行組織學(xué)鑒定，余下部分按照Trizol試劑盒要求進(jìn)行總RNA提取及cDNA鏈合成，最后按95℃，3 min預(yù)變性；95℃，5 s變性；56℃，10 s退火；72℃，25 s延伸；39℃循環(huán)的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以2-△△Ct結(jié)果形式進(jìn)行分析，具體如下：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組目的基因）-△Ct（對(duì)照組目的基因）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較時(shí)采用單因素方差分析，符合正態(tài)性分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，選LSD檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組深靜脈血栓形成后股靜脈的顏色、形態(tài)比較27只經(jīng)造模處理的大白兔術(shù)后24 h肉眼狀態(tài)下可見股靜脈顏色明顯變暗、甚至呈紫黑色，同時(shí)管腔增粗，有明顯黑色血凝塊充斥其中，甚至全節(jié)段腫脹，提示股靜脈血栓形成（圖1，2）；而假手術(shù)組的大白兔股靜脈顏色偏紅，管腔未見腫脹及凝血塊，提示無血栓形成（圖 3）。

圖1

圖2

圖3

2.2 各組HE染色結(jié)果比較 經(jīng)造模處理24 h的大白兔股靜脈HE染色可見血栓充斥管腔內(nèi)，同時(shí)與管壁黏附，散在有部分血管壁脫落的內(nèi)皮細(xì)胞（圖4），3、7 d后消栓飲組可見血栓逐漸消退，管腔部分再通（圖5、6）；假手術(shù)組僅發(fā)現(xiàn)管壁內(nèi)皮細(xì)胞脫落，未見血栓形成（圖 7）。

圖4

圖5

圖6

圖7

2.3 各組兔靜脈壁NF-κB p65水平比較 見表1。術(shù)后同時(shí)期D、E組NF-κB p65水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D 組組內(nèi)比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；術(shù)后 1 d，A、B、C 組的 NF-κB p65含量高于 D 組（P＜0.05）；A、B、CNF-κB p65 mRNA 水平組內(nèi)比較， 其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B組與C組在同時(shí)期相比（P＜0.01）；A、B兩組在同時(shí)期相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組靜脈壁NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組靜脈壁NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

與 D 組比較，*P＜0.05；與 C 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與同組術(shù)后 1 d比較，#P＜0.01，與術(shù)后 3 d比較，▲P＜0.05。 下同。

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2.4 各組兔靜脈壁IKBa含量比較 見表2。術(shù)后同時(shí)期D、E組IKBa mRNA水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D 組組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；術(shù)后1 d，A、B、C組的IKBa mRNA含量低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；A、B、CIKBa mRNA 水平組內(nèi)比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B組與C組在同時(shí)期相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；A、B兩組在同時(shí)期相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組靜脈壁IKBa mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組靜脈壁IKBa mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

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2.5 各組血清NF-κB水平的比較 見表3。術(shù)后同時(shí)期D、E組NF-κB相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），D組組內(nèi)比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后1 d，A、B、C組的NF-κB含量均明顯高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí) A、B、C 3 組 NF-κB 水平組內(nèi)比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A、B組與C組在同時(shí)期相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B 兩組在同時(shí)期相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組血清NF-κB OD值比較（±s）

表3 各組血清NF-κB OD值比較（±s）

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3 討 論

目前，DVT已經(jīng)成為骨科大手術(shù)術(shù)后嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至導(dǎo)致死亡的重要并發(fā)癥之一，合理、個(gè)體化、足療程的抗凝治療仍是骨科術(shù)后DVT的重要預(yù)防措施［4-5］。低分子肝素鈉是由低分子量的肝素解聚而成，臨床實(shí)驗(yàn)證明低分子肝素鈉在常規(guī)的預(yù)防劑量下不會(huì)顯著改變活化部分凝血酶時(shí)間，在多年的臨床實(shí)踐中被認(rèn)為是國內(nèi)應(yīng)用最廣泛而且安全可靠的抗凝藥物。

研究表明炎癥反應(yīng)與血栓形成密不可分［6］。Rabinovich A等［7］指出，血栓形成后可以直接引起血管壁的炎癥反應(yīng)，包括白細(xì)胞的聚集、活化及炎癥因子的表達(dá)等，造成血管內(nèi)膜的損傷，導(dǎo)致血液高凝，進(jìn)一步加重血栓形成。NF-κB作為一種多靶點(diǎn)的核轉(zhuǎn)錄因子，是多種炎性反應(yīng)過程的樞紐和中心環(huán)節(jié)［8］，其生物學(xué)活性取決于p65/p50與IKBa蛋白的降解和轉(zhuǎn)移。NF-κB廣泛參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，目前臨床上已有大量藥物的抗炎治療被證實(shí)是通過抑制NF-κB的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，例如糖皮質(zhì)激素［9］。NF-κB信號(hào)通路的活化調(diào)控炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，NF-κB的表達(dá)水平同樣能反映炎癥的變化趨勢(shì)，在炎癥相關(guān)性疾病中作為疾病發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的生物學(xué)標(biāo)志。

近年有關(guān)NF-κB信號(hào)通路與DVT的研究大都是通過中斷NF-κB調(diào)控的炎癥反應(yīng)來減少血栓的形成［10］。NF-κB通路引起血栓形成機(jī)制大體如下：外界因素的刺激使得發(fā)生核轉(zhuǎn)移的NF-κB增強(qiáng)了靶基因表面的DNA結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)黏附因子、細(xì)胞因子、各種酶的釋放，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為NF-κB各種群重要表達(dá)區(qū)域，首先受到各種細(xì)胞因子的沖擊，受損后的血管內(nèi)皮出現(xiàn)凝血功能的紊亂，大量的血小板、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞過度聚集、黏附，造成血管壁的進(jìn)一步損傷及血液高凝，誘發(fā)血栓形成；閻偉證實(shí)了NF-κB的活化能調(diào)控大鼠血栓的發(fā)展，通過阻止NF-κB的表達(dá)來減輕中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)，體現(xiàn)了從炎癥-血栓途徑的血管內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在血栓形成后，模型組NF-κB p65 mRNA較空白組明顯上升，而IKBa mRNA水平下降，提示血管內(nèi)皮損傷后激活了NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控炎性損傷，表明NF-κB激活調(diào)控的炎癥反應(yīng)在DVT發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

消栓飲全方以黃芪為君，取其甘溫益氣，通利血脈，氣盛血自行，祛瘀不傷正，桂枝溫經(jīng)通脈，除血痹，與黃芪相伍，益氣溫陽，營衛(wèi)氣血和利，脈絡(luò)充盛。白芍入營理血，與桂枝合用，增強(qiáng)和營通脈之功；丹參、歸尾補(bǔ)血活血，祛瘀不傷血，牛膝宣散降逆，下血通脈，并引諸藥下行，大腹皮、陳皮、枳殼，能寬中除滿，行氣導(dǎo)滯；茯苓、豬苓、澤瀉利水滲濕，與桂枝同用，又有溫陽化氣散水氣之功；甘草調(diào)和諸藥。全方合用補(bǔ)而不滯，行而不傷，共奏益氣活血、消栓通脈之功。

在前期大量科研實(shí)驗(yàn)證明其改善血液流變學(xué)指標(biāo)、抗凝、促纖溶的作用與治療創(chuàng)傷性深靜脈血栓緊密相連［12-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)消栓飲干預(yù)后的兔靜脈壁NF-κB p65 mRNA及血清NF-κB表達(dá)顯著下降，IKBa mRNA表達(dá)上升，提示消栓飲可以有效調(diào)控血栓形成后NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低靜脈壁中NF-κB p65及血清NF-κB表達(dá)、促進(jìn)IKBa表達(dá)，從而減輕血管壁炎性損傷，加速修復(fù)；提示調(diào)控NF-κB信號(hào)通路是消栓飲治療深靜脈血栓的途徑之一。

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