葛寶慶 胡素賢 孫鐵鐸 張崇穎 姜廣順

(1.國家林業(yè)局貓科動物研究中心;東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040;2.東北林業(yè)大學(xué)圖書館，哈爾濱，150040;3.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計研究院，長春，130021;4.吉林省天橋嶺林業(yè)局，汪清，133204)

野豬(Sus scrofa)，隸屬于哺乳綱、偶蹄目(Artiodactyla)、豬科(Suidae)、豬屬動物，共有8屬22種［1］，其分布范圍廣泛，以歐洲、亞洲與非洲分布最廣，在半干旱氣候至熱帶雨林、溫帶林地、草原等都有其分布，但是在極為干旱、海拔極高與寒冷的地區(qū)難以發(fā)現(xiàn)其蹤跡。除戈壁沙漠與青藏高原外，在中國境內(nèi)均有野豬分布，野豬主要集中分布在東北三省、云貴地區(qū)、福建、廣東地區(qū)。其中分布在中國東北的是烏蘇里野豬(S．s．ussuricus)。近年來，由于棲息地質(zhì)量下降與人為獵殺，野豬種群數(shù)量在逐漸減少［2］。

對野豬種群數(shù)量和種群特征的監(jiān)測是野豬種群資源管理的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的野生動物種群監(jiān)測和管理技術(shù)，包括直接觀察、個體計數(shù)、足跡識別、測量跟蹤和記錄獵物［3］。但這些傳統(tǒng)技術(shù)幾乎是不可能為精確管理方法，如性別比例、個體間關(guān)系、遺傳多樣性、種群分化、亞種群間基因流和近親繁殖或遠(yuǎn)親繁殖水平，提供所需的關(guān)鍵信息。從而，野生動物的保護(hù)研究逐漸從宏觀的研究手段過渡到微觀手段，來揭示野生動物種群資源動態(tài)的特征。

遺傳多樣性能夠反應(yīng)遺傳變異的水平，是衡量種群生存、進(jìn)化以及對環(huán)境條件適應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)。棲息地質(zhì)量的下降以及強(qiáng)烈的人為活動會在分子、細(xì)胞與個體水平上對動物產(chǎn)生影響，造成動物遺傳變異水平下降。遺傳多樣性水平的下降將會削弱動物對環(huán)境的適應(yīng)能力，導(dǎo)致動物擴(kuò)散遷移能力降低，近交程度增加，動物個體生存能力下降。目前使用分子標(biāo)記技術(shù)研究野豬的種群遺傳學(xué)還較少。如蘭宏等利用線粒體DNA序列分析了西南地區(qū)家豬和野豬遺傳多樣性［4］，Vernesi等使用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了在種群數(shù)量減少和重引入對野豬的遺傳影響［5］，李崇奇采用線粒體變異探討了野豬系統(tǒng)地理學(xué)和家豬起源［6］，張晨嶺使用微衛(wèi)星標(biāo)記探討了中國大陸地區(qū)野豬的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，表明了中國大陸地區(qū)的野豬較國外野豬有更高的遺傳多樣性［7］。同樣，霍金龍等使用76個微衛(wèi)星標(biāo)記對云南南部地區(qū)野豬群體的遺傳多樣性進(jìn)行評估，也表明該野豬群體遺傳多樣性較豐富［8］。韓春梅等使用mtDNA控制區(qū)序列評估了新疆野豬遺傳多樣性，闡明了新疆野豬與亞洲野豬和國內(nèi)地方豬種之間的遺傳關(guān)系較近［9］。然而，關(guān)于東北地區(qū)野豬種群遺傳多樣性的研究較少。本研究通過采集長白山北部5個林區(qū)的野豬糞便樣本，結(jié)合微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，評估長白山北部區(qū)域野豬種群的遺傳多樣性水平和近交程度，為制定野豬種群保護(hù)和利用策略提供遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及保存

2014～2016年期間，在長白山北部的5個采樣地點采用系統(tǒng)布樣的設(shè)計方法，分別在汪清自然保護(hù)區(qū)共布設(shè)19條樣線，張廣才嶺南部林區(qū)共布設(shè)25條樣線，琿春自然保護(hù)區(qū)共布設(shè)18條樣線，天橋嶺自然保護(hù)區(qū)共布設(shè)20條樣線，穆棱林區(qū)中共布設(shè)19條長度大于5 km的樣線，尋找野豬足跡。

在樣線上發(fā)現(xiàn)新鮮的野豬足跡后，沿著足跡鏈跟蹤，保證跟蹤距離達(dá)到3 km以上。在跟蹤足跡的過程中，為避免重復(fù)取樣，在一條野豬足跡鏈上只采取一堆糞便樣本。用一次性PE手套將糞便樣品裝入封口袋中，并記錄采樣時間、地點、足跡鏈編號、經(jīng)緯度及采集人。每次收集糞便時要更換PE手套和收集袋，避免交叉污染。由于冬天研究地區(qū)的溫度大多低于－20℃，所以收集到的糞便樣品可直接放在室外陰暗處保存。糞便樣品從野外采集結(jié)束后，將糞便樣品送回實驗室，在－20℃的低溫冰箱中冷凍保存。

在5個地點共收集疑似野豬糞便樣品140份，其中汪清(WQ)共計36份，琿春(HC)共計35份，張廣才嶺南(ZGCLN)共計23份，天橋嶺(TQL)共計27份，穆棱(ML)共計19份。

1.2 DNA提取

DNA Stool Mini Kit試劑盒(產(chǎn)自德國QIAGEN公司)對糞便樣本提取DNA。使用苯酚－氯仿抽提法提取野豬肌肉樣本 DNA。在 4℃或者 －20℃下保存DNA。

1.3 特異性引物及微衛(wèi)星位點信息

SSR(simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列)，又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，是指含有1～6個堿基對的短串聯(lián)重復(fù)DNA序列，常見的是雙核苷酸重復(fù)，如(CA)n和(TG)n。微衛(wèi)星DNA重復(fù)單位數(shù)目為10～60個，重復(fù)單元數(shù)目的差異和重復(fù)程度的不同造成微衛(wèi)星DNA片段長度差異，差異使得同一基因座位在一物種中存在很多的等位基因，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性［10］。微衛(wèi)星DNA由于其多態(tài)性高，信息量大，實驗步驟少且簡單，實驗結(jié)果穩(wěn)定，DNA需求量少等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)分析。本研究采用世界糧農(nóng)組織(FAO)推薦的適于野豬遺傳學(xué)分析的9個微衛(wèi)星標(biāo)記。

使用野豬特異性引物進(jìn)行物種鑒定，上游引物序列為5'-GACTAGGAACCATGAGGTTGCG-3'，下游引物序列為5'-AGCCTACACCACAGCCACAG-3'，擴(kuò)增片段大小為134 bp，PCR擴(kuò)增時退火溫度為63℃［11］。微衛(wèi)星位點信息見表1。所有引物都由上海生工生物有限公司合成。

表1 微衛(wèi)星位點信息Tab.1 Microsatellite markers information

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 Buffer 10 μL、dNTPs 4 μL、Taq 酶 0.3 μL、上游引物 0.75 μL、下游引物0.75 μL、DNA 1 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足體系到 20 μL。

PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃，預(yù)變性2 min后;98℃，變性20 s;在各引物退火溫度下，退火30 s;68℃ 延伸20 s;擴(kuò)增35個循環(huán)后，最后以68℃延伸10 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在含有核酸染料Golden View的1%瓊脂糖凝膠中，以120 V的電壓電泳30 min。最后在UVP凝膠成像系統(tǒng)上紫外透射觀察，照相，保存。每個樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增3～5次，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

使用ABI3730X1測序儀對所有微衛(wèi)星位點熒光標(biāo)記下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型分型?；蛐团凶x時，若3次PCR擴(kuò)增中，出現(xiàn)3次復(fù)等位基因則判斷為雜合子。若不能判斷為雜合子，則再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)多次結(jié)果，判斷為純合子還是雜合子。若多次擴(kuò)增之后，仍無法判斷，則舍棄樣本。

1.5 統(tǒng)計分析

使用Excel的Microsatellite Toolkit進(jìn)行個體鑒定。使用Gimlet軟件計算微衛(wèi)星位點的個體聯(lián)合判別率。使用GenAIEx計算如下遺傳參數(shù):等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)，Hardy-Weinberg平衡檢驗、雜合度、多態(tài)信息含量(PIC)、Shannon指數(shù)和F－統(tǒng)計值。

2 結(jié)果

2.1 個體判別率

使用Gimlet軟件，得到9個微衛(wèi)星位點的個體聯(lián)合判別率，結(jié)果見表2。如圖1所示，當(dāng)聯(lián)合使用前5個微衛(wèi)星位點分析時，就可以進(jìn)行無偏差個體判別。當(dāng)使用前7個微衛(wèi)星位點分析時，就可以達(dá)到全同胞個體判別的要求。本文使用的9個微衛(wèi)星位點對樣本進(jìn)行個體鑒別時，全同胞基因型相似概率為0.0001415。研究采用的9個微衛(wèi)星位點能滿足個體判別的需要。

表2 微衛(wèi)星位點個體判別率和多態(tài)信息含量(PIC)Tab.2 PI-idiotype similar probability and polymorphism information content(PIC)

9個微衛(wèi)星位點PIC值結(jié)果見表2。微衛(wèi)星位點PIC最小值為0.625(SW857)，最大值為0.888(S0226)。所有微衛(wèi)星位點的PIC值均大于0.5，表明本研究使用的微衛(wèi)星位點都為高度多態(tài)性位點，可以滿足實驗要求。

2.2 物種鑒定和個體數(shù)量

使用物種特異性引物對收集到的140份糞便樣本進(jìn)行物種鑒定時，只有32號、62號糞便樣本在瓊脂糖凝膠電泳實驗時沒有檢測到有效的條帶。利用微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，有些樣本無法得到有效的擴(kuò)增片段，故舍棄掉這些樣本不用于接下來的遺傳分析。

使用Excel中的Microsatellite Toolkit對101份野豬DNA進(jìn)行個體鑒定。經(jīng)鑒定，琿春有23個野豬個體，張廣才嶺南有14個野豬個體，汪清有19個野豬個體，天橋嶺有13個野豬個體，穆棱有16個野豬個體。

2.3 等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)(Ne)和基因頻率

9個微衛(wèi)星標(biāo)記得到的等位基因數(shù)及各種群實際等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)結(jié)果見表3。

表3 各種群9個微衛(wèi)星位點的實際等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和等位基因數(shù)目(k)Tab.3 The number of actual alleles(Na)，effective alleles(Ne)for different combinations of locus-population and for each population，number of alleles for each loci

9個微衛(wèi)星標(biāo)記得到的等位基因數(shù)變化范圍為6～15個，SW857位點的等位基因數(shù)最少，S0101位點的等位基因數(shù)最大。S0005位點在222 bp上的等位基因頻率最高，為0.65625。整體來看，所有種群的平均實際等位基因數(shù)量中，天橋嶺種群的平均實際等位基因數(shù)最小，為5.444個，穆棱種群的平均等位基因數(shù)最大，為8個。所有種群的平均有效等位基因數(shù)量中，天橋嶺種群的平均有效等位基因數(shù)最小，為3.368個，穆棱種群的平均有效等位基因數(shù)最大，為5.144個。

本研究中的5個種群中，琿春種群Ne與Na之間差異最大的位點為S0005位點(5.624)，張廣才嶺南種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0227位點(3.574)，汪清種群中Ne與Na之間差異最大的位點為SW72(5.624)，天橋嶺種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0226位點(4.721)，穆棱種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0090位點(5.150)。

2.4 雜合度

各種群9個微衛(wèi)星位點的表觀雜合度、期望雜合度及平均雜合度，結(jié)果見表4。在5個種群中，天橋嶺種群平均期望雜合度最小，為0.687，琿春種群平均期望雜合度最大，為0.766。張廣才嶺南種群平均表觀雜合度最小，為0.762，穆棱種群平均表觀雜合度最大，為0.813。平均表觀雜合度均大于平均期望雜合度。

表4 各種群9個微衛(wèi)星位點的表觀雜合度(Ho)和期望雜合度(He)及平均雜合度Tab.4 The observed heterozygosity(Ho)，the expected heterozygosity(He)and mean heterozygosity different combinations of locus-population and for each population

2.5 Hardy-Weinberg平衡檢驗

各種群每個位點Hardy-Weinberg平衡檢驗的P值及顯著性結(jié)果見表5。9個微衛(wèi)星位點Hardy-Weinberg平衡檢驗中，琿春種群的S0226位點，P值為0.011(＜0.05);張廣才嶺南種群的S0101位點，P值為0.023(＜0.05);汪清種群的S0005位點和S0101位點，P值都為0.000(＜0.001);天橋嶺種群的SW72位點，P值為0.020(＜0.05);穆棱種群的S0225位點，P值為0.034(＜0.05)，這些位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。各種群的其余位點未顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。5個種群的45個Hardy-Weinberg平衡檢驗中，共有6個(約13.3%)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

表5 各種群9個微衛(wèi)星位點的Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗的P值及顯著性Tab.5 P value and significance of Hardy-Weinberg equilibrium

2.6 Shannon指數(shù)

各種群9個位點Shannon指數(shù)的平均值中，天橋嶺種群的平均Shannon指數(shù)最小，為1.359，穆棱種群的平均Shannon指數(shù)最大，為1.729，琿春種群平均Shannon指數(shù)為1.688，張廣才嶺南種群平均Shannon指數(shù)為1.580，汪清種群平均 Shannon指數(shù)為1.532。

2.7 F－統(tǒng)計值

9個微衛(wèi)星位點的F－統(tǒng)計值(Fis、Fit、Fst)結(jié)果見表6。在9個位點中，F(xiàn)is值的范圍在－0.206到0.074之間，只有S0005微衛(wèi)星位點的Fis值大于0，其余8個微衛(wèi)星位點的Fis值均小于0。

3 討論

多態(tài)信息含量(PIC)作為衡量微衛(wèi)星位點多態(tài)性的重要指標(biāo)。本研究采用的9個微衛(wèi)星位點的PIC值變化范圍在0.625(SW857)～0.888(S0226)，PIC值均大于0.5。根據(jù)Botstein等的建議，當(dāng)PIC＞0.5時，位點為高度多態(tài)性位點［12］。因此，本研究所采用的9個微衛(wèi)星位點都為高度多態(tài)性位點，這就滿足了遺傳多樣性研究要求，研究結(jié)果更為可靠。同時，每一個位點的等位基因數(shù)目的大小也能表明所篩選的微衛(wèi)星位點是否適合研究該物種的遺傳多樣性。本研究中的9個微衛(wèi)星位點，等位基因數(shù)目的變化范圍在6(SW857)～15(S0101)個。9個微衛(wèi)星位點得到的等位基因數(shù)目比較多，表明了所選位點能正確評價群體間的遺傳關(guān)系，所有的微衛(wèi)星位點都適合于分析野豬的遺傳多樣性。然而，霍金龍等［8］評估云南南部地區(qū)野豬遺傳多樣性時，采用76個微衛(wèi)星標(biāo)記探測到等位基因數(shù)目在3～9個之間，微衛(wèi)星標(biāo)記的PIC值在0.3701～－0.8624，小于本研究的9個微衛(wèi)星標(biāo)記的PIC值及等位基因數(shù)目。

有效等位基因數(shù)(Ne)是一個衡量遺傳變異程度的指標(biāo)。Ne與Na之間的差異，能說明某等位基因在群體內(nèi)分布的均勻程度。當(dāng)Ne與Na之間的差異越小，表明該等位基因在群體內(nèi)分布的均勻度越好?，q春種群的S0005位點、張廣才嶺南種群的S0227位點、汪清種群的SW72位點、天橋嶺種群的S0226位點和穆棱的S0090位點，等位基因的均勻度較其他的8個微衛(wèi)星位點較差。

雜合度是衡量遺傳多樣性的一個重要指標(biāo)。本研究中，各微衛(wèi)星位點的表觀雜合度在0.478～1.000之間，期望雜合度在0.494～0.889之間。這與霍金龍等［8］得到的76個微衛(wèi)星標(biāo)記的表觀雜合度在0.409～1.000之間和期望雜合度在0.406～0.8765之間相一致。本研究的5個種群的平均表觀雜合度都大于平均期望雜合度。這表明種群雜合子比例較高，發(fā)生近交的可能性少，遺傳一致性較低，群體遺傳多樣性較高。

F－統(tǒng)計量是用來衡量種群遺傳差異程度的指標(biāo)。Fis是指亞群體的固定指數(shù)，F(xiàn)it是指總?cè)后w的固定指數(shù)，F(xiàn)st是指亞群體間的基因分化率。本研究中的9個微衛(wèi)星位點的Fis值變化范圍為－0.206(SW857)到0.074(S0005)。所有微衛(wèi)星位點的Fis值均小于Fit值。9個微衛(wèi)星位點的平均Fis值為－0.073，平均Fit值為－0.007，平均Fst值為0.062。這就表明總?cè)后w比亞群間更穩(wěn)定，即5個種群之間存在一定程度的分化。同時，F(xiàn)is也是衡量雜合子水平的指數(shù)。Fis值的變化范圍在－1到1之間。當(dāng)Fis大于0時，表明群體內(nèi)的雜合子水平較低，純合子水平較高;當(dāng)Fis小于0時，表明群體內(nèi)的雜合子水平較高，純合子水平較低。張晨嶺［7］使用11個微衛(wèi)星標(biāo)記計算得中國6個區(qū)域野豬種群的Fis值在0.06～0.20之間，野豬群體內(nèi)部的純合子多，雜合子少。而本研究Fis值大部分為負(fù)值，表明了沒有呈現(xiàn)雜合子缺乏的情況，近交程度較低。

Shannon指數(shù)是反映群體離散程度的一個重要指標(biāo)。Shannon指數(shù)普遍變化范圍為1.5到3.5［13］。本研究中種群Shannon指數(shù)平均值最大的為1.729(穆棱)，平均值最小的為1.359(天橋嶺)。Shannon指數(shù)越大，表明群體的離散程度越高，群體遺傳多樣性越高。這就表明，從Shannon指數(shù)來看，群體遺傳多樣性從高到低，依次為穆棱、琿春、張廣才嶺南、汪清、天橋嶺?？傮w來說，5個種群的Shannon指數(shù)都較高，表明受近交的影響較小。

根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，其假設(shè)的群體是一個理想群體，該理想群體在隨機(jī)交配的過程中，種群中的基因頻率和基因型頻率不變。本研究中，Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗結(jié)果可以看出，各種群的9個微衛(wèi)星位點，只有少部分微衛(wèi)星位點處于偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)很可能是群體并不符合隨機(jī)交配，受到物種突變、遷移等影響。

4 結(jié)論

本研究初步篩選出了長白山北部野豬遺傳多樣性的微衛(wèi)星標(biāo)記。所篩選的9個微衛(wèi)星位點在遺傳學(xué)分析應(yīng)用中獲得的結(jié)果可靠。通過使用所篩選的微衛(wèi)星位點對長白山北部野豬種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明5個區(qū)域的種群均具有較豐富的遺傳多樣性，近交程度低。這對今后進(jìn)行野豬種群保護(hù)和管理策略的制定有重要意義。而且，野豬作為東北虎的主要捕食對象，保持野豬種群較高的多樣性，對東北虎保護(hù)和管理也有積極意義。

冠心病是一種臨床多因素疾病,多因冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,冠心病具有較高的發(fā)病率與死亡率,隨著人口老齡化的加劇,冠心病發(fā)病率呈逐漸增長趨勢[1]。對于冠心病高危人群進(jìn)行早期診斷與早期干預(yù)對于冠心病的發(fā)生具有降低作用,可使患者的危害有效降低。本次研究對血清膽紅素與尿酸在冠心病患者的臨床檢測價值進(jìn)行對比分析,現(xiàn)報告如下。

致謝:感謝國家林業(yè)局野生動物與自然保護(hù)區(qū)管理司“虎、東北豹資源調(diào)查技術(shù)研究”和“東北虎、東北豹種群及棲息地調(diào)查評估標(biāo)準(zhǔn)制定及信息匯總”項目的資助;感謝浙江大學(xué)方盛國教授給予實驗室分子生物學(xué)技術(shù)的咨詢和幫助;感謝國家林業(yè)局貓科動物研究中心對野外樣本與數(shù)據(jù)信息的提供。

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