劉美欣 趙 雨 張 梅 劉宇昕 胡耀中 幺寶金*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長(zhǎng)春，130117;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐中心，長(zhǎng)春，130117)

鹿茸為鹿科動(dòng)物未骨化密生茸毛的幼角，鹿茸驚人的生長(zhǎng)速度一直是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，在快速生長(zhǎng)期(生茸后 60 d)，鹿茸的生長(zhǎng)速度可達(dá) 2 cm/d［1－4］。鹿茸的生長(zhǎng)主要由鹿茸頂端生長(zhǎng)中心驅(qū)動(dòng)和控制，通過(guò)軟骨內(nèi)骨化過(guò)程實(shí)現(xiàn)，生長(zhǎng)中心主要包括茸皮、間充質(zhì)和軟骨組織［5－7］。因此，鹿茸可以作為研究軟骨生長(zhǎng)和發(fā)育機(jī)制的良好模型。鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織中富含大量血管組織，與正常的軟骨組織存在巨大差異，這與鹿茸具有驚人的生長(zhǎng)速度并且可以修復(fù)再生必然存在聯(lián)系［8－10］。因此，研究不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸軟骨組織基因表達(dá)變化，對(duì)于揭示鹿茸快速生長(zhǎng)機(jī)制具有重要意義。同時(shí)，對(duì)于軟骨組織損傷修復(fù)和骨關(guān)節(jié)退行性疾病的相關(guān)研究具有重要的指導(dǎo)作用。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)為代表的組學(xué)研究在基因表達(dá)分析研究中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄組指特定組織或細(xì)胞在某個(gè)發(fā)育階段或某種特定生理病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)錄出來(lái)的全部RNA的總和。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)是指利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，研究特定組織或細(xì)胞的全部轉(zhuǎn)錄本情況，揭示其基因表達(dá)水平與變化，進(jìn)而揭示其具體分子作用機(jī)制。與傳統(tǒng)測(cè)序方法如Sanger法測(cè)序、基因芯片等相比較，具有樣品用量少、分辨率和準(zhǔn)確度高、價(jià)格低和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)［11－15］。同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)參考基因組物種進(jìn)行從頭測(cè)序［16－19］。本研究采用 RNA-seq技術(shù)對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)Trinity軟件［20］對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行從頭組裝和拼接，通過(guò)生物信息學(xué)分析方法篩選不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸軟骨組織差異表達(dá)基因，這些研究結(jié)果對(duì)于揭示鹿茸快速生長(zhǎng)機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取4歲齡健康的東北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)6只，分別于生茸后60 d(快速生長(zhǎng)期)和90 d(骨化期)時(shí)采集兩側(cè)的鹿茸頂端生長(zhǎng)組織(距離頂端長(zhǎng)度5 cm)。按照Li等［7］的實(shí)驗(yàn)方法分離鹿茸頂端軟骨組織，置于純化水中反復(fù)漂洗后切成小塊，迅速置于液氮罐中保存。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸軟骨組織總RNA提取制備

采用TRIzol(Invitrogen，USA)法從鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織中提取總RNA，通過(guò)Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，USA)來(lái)評(píng)估RNA完整性。

1.2.2 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

采用 TruSeq Stranded mRNA試劑盒(Illumina，USA)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。具體方法為:采用oligo(dT)偶聯(lián)磁珠(Life technologies，USA)從總RNA中純化富集mRNA，并進(jìn)行mRNA片段化;經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成雙鏈cDNA，經(jīng)核糖核酸酶處理除去剩余mRNA;經(jīng)末端修復(fù)和接頭連接后，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得最終的測(cè)序文庫(kù)。

1.2.3 文庫(kù)測(cè)序和生物信息學(xué)分析

在Illumina Hiseq 2000平臺(tái)(Illumina，USA)上進(jìn)行文庫(kù)測(cè)序。采用Illumina HCS 1.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，去除低質(zhì)量序列和載體序列。采用Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝。通過(guò)BLASTX比對(duì)程序，以E值＜10－5為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將測(cè)序組裝數(shù)據(jù)與nr、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。采用RPKM法［21］進(jìn)行基因表達(dá)量分析，采用DEGseq軟件包［22］對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期軟骨組織進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:差異表達(dá)倍數(shù)在2倍以上(即log2［Fold change］≥1或≤－1，F(xiàn)old change=骨化期 RPKM/快速生長(zhǎng)期RPKM)，且假發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.001。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序和組裝

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織中分別獲得4.47和4.45 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)。其中，raw reads分別為45423156和45422448條，去除載體序列和低質(zhì)量序列后，分別獲得44715694和44535200條clean reads，測(cè)序質(zhì)量值Q20值分別為98.44和98.05。通過(guò) Trinity軟件組裝，分別獲得39377和37331條組裝序列(Unigenes)，平均長(zhǎng)度分別為1138和1143 nt。Unigenes長(zhǎng)度分布見圖1。

圖1 快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織Unigenes長(zhǎng)度分布Fig.1 Unigenes length distribution of antler cartilage tissue at rapid growth and ossification stages

2.2 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及差異基因表達(dá)分析

通過(guò)BLASTX比對(duì)程序，將Unigenes與nr、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以E值＜10－5為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)與2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上的Unigenes共有20551條。針對(duì)這些Unigenes，采用RPKM法進(jìn)行基因表達(dá)量分析，采用DEG-seq軟件包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，共篩選出4422條差異表達(dá)基因(log2［Fold change］≥1或≤－1;FDR≤0.001)。與快速生長(zhǎng)期比較，骨化期顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因有2493條，顯著下調(diào)的差異表達(dá)基因有1929條。我們針對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，找出與軟骨生長(zhǎng)和骨化相關(guān)的差異表達(dá)基因，這些基因主要包括生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和膠原類成分。

2.2.1 生長(zhǎng)因子(growth factor)類差異表達(dá)基因

在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織差異表達(dá)基因中，共篩選出7種生長(zhǎng)因子(表1)。其中，與快速生長(zhǎng)期比較，骨化期鹿茸軟骨組織中表達(dá)量顯著下調(diào)的生長(zhǎng)因子有6種，分別為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFD、表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白EGFL6、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF7和FGF11;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-C表達(dá)量顯著上調(diào)。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織生長(zhǎng)因子類差異表達(dá)基因Tab.1 Differential growth factors of antler growth center cartilage at different growth stages

2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)類差異表達(dá)基因

在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織差異表達(dá)基因中，共篩選出12種轉(zhuǎn)錄因子(表2)。其中，與快速生長(zhǎng)期比較，骨化期鹿茸軟骨組織中表達(dá)量顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有 7種，分別為轉(zhuǎn)錄因子 ATF6β、SOX12、ELF2、ELF4、RUNX1、MAFK和 TCF4;表達(dá)量顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有5種，分別為轉(zhuǎn)錄因子SOX9、GTF3A、SOX8、ATF3和 MAFF。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織轉(zhuǎn)錄因子類差異表達(dá)基因Tab.2 Differential transcription factors of antler growth center cartilage at different growth stages

2.2.3 膠原(collagen)類差異表達(dá)基因

在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織差異表達(dá)基因中，共篩選出8種類型膠原(表3)。其中，與快速生長(zhǎng)期比較，骨化期鹿茸軟骨組織中表達(dá)量顯著下調(diào)的膠原有3種，分別為膠原COL16A1、COL8A1和COL14A1;表達(dá)量顯著上調(diào)的膠原有5種，分別為膠原 COL10A1、COL27A1、COL9A1、COL2A1 和COL25A1。

表3 不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織膠原類差異表達(dá)基因Tab.3 Differential collagens of antler growth center cartilage at different growth stages

3 討論

鹿茸的快速生長(zhǎng)機(jī)制一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。要系統(tǒng)和全面地揭示這一獨(dú)特的生長(zhǎng)機(jī)制，就必須對(duì)鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中的基因表達(dá)變化進(jìn)行深入分析?；贗llumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具有快速、高效、低成本等特點(diǎn)，可以對(duì)任意物種的組織或細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息，尤其適合于研究缺少基因組信息的非模式生物的轉(zhuǎn)錄組情況。本課題組在前期研究工作中針對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸頂端生長(zhǎng)中心的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行較為深入的分析，篩選出多種調(diào)控鹿茸快速生長(zhǎng)和骨化的差異表達(dá)基因［23－25］。然而，這些研究結(jié)果無(wú)法反映鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)中心的軟骨組織的基因表達(dá)變化。本研究針對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序，采用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝、拼接、比對(duì)和差異基因表達(dá)分析，篩選出7種差異表達(dá)生長(zhǎng)因子，12種差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和8種差異表達(dá)膠原。

在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-D、表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白EGFL6、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF7和FGF11在快速生長(zhǎng)期表達(dá)量較高，在骨化期表達(dá)量顯著下調(diào)，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-C在快速生長(zhǎng)期表達(dá)量較低，在骨化期表達(dá)量顯著上調(diào)。這些研究結(jié)果表明鹿茸的快速生長(zhǎng)受到這些生長(zhǎng)因子的協(xié)同調(diào)控作用。VEGF-D和VEGF-C是2種血管內(nèi)皮細(xì)胞因子亞型，具有促進(jìn)血管和淋巴管形成等功能［26］。表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白EGFL6的功能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相似，具有促血管生成作用，尤其在腫瘤組織中表達(dá)量較高［27］。這些研究結(jié)果提示我們這3種生長(zhǎng)因子對(duì)鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中軟骨組織中血管的生成具有重要的調(diào)控作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF1是一種多功能生長(zhǎng)因子，對(duì)于細(xì)胞的存活、增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用。IGF1軟骨特異性基因敲除小鼠出現(xiàn)軟骨細(xì)胞增殖減少，分化和肥大延遲，細(xì)胞凋亡增加，軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程遲緩等現(xiàn)象［28］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF7和FGF11三種生長(zhǎng)因子在組織損傷修復(fù)和再生過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［29－31］。這些研究結(jié)果表明鹿茸快速生長(zhǎng)受到 IGF1、HGF、VEGF和EGF6等多種生長(zhǎng)因子的協(xié)同調(diào)控。

在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中，SOX9、GTF3A、SOX8、ATF3和MAFF的表達(dá)量在骨化期表達(dá)量顯著上調(diào)，而ATF6β、SOX12、ELF2、ELF4、RUNX1、MAFK和TCF4的表達(dá)量在骨化期表達(dá)量顯著下調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子主要集中為SOX家族、ATF家族和ELF家族。其中，SOX家族成員包括SOX8、SOX9和SOX12，這3種轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨及多種組織器官形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［32］。ATF家族成員包括 ATF3、ATF6β，這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于應(yīng)激條件下軟骨細(xì)胞存活和凋亡具有重要調(diào)控作用［33］。除此之外，RUNX1也是軟骨生長(zhǎng)過(guò)程中重要的調(diào)控因子［34］。這些研究結(jié)果表明鹿茸快速生長(zhǎng)受到SOX8、SOX9、SOX12、ATF3、ATF6β和RUNX1等多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控。

在不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸軟骨組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們也發(fā)現(xiàn)了許多表達(dá)量存在顯著差異的膠原類成分，與快速生長(zhǎng)期比較，骨化期鹿茸軟骨組織中表達(dá)量顯著下調(diào)的膠原有 3種，分別為膠原 COL16A1、COL8A1和COL14A1;表達(dá)量顯著上調(diào)的膠原有5種，分別為膠原 COL10A1、COL27A1、COL9A1、COL2A1和 COL25A1。其中，COL10A1、COL9A1和COL2A1廣泛存在于軟骨組織中，是重要的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分，在軟骨形成和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［35］。這些研究結(jié)果表明鹿茸快速生長(zhǎng)和骨化過(guò)程中膠原表達(dá)量發(fā)生巨大改變，有關(guān)這些膠原基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍然有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期東北梅花鹿茸生長(zhǎng)中心軟骨組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。通過(guò)差異基因表達(dá)分析篩選出7種差異表達(dá)生長(zhǎng)因子，12種差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和8種差異表達(dá)膠原。這些差異表達(dá)基因?qū)τ诼谷椎目焖偕L(zhǎng)和骨化具有重要的調(diào)節(jié)作用，本研究結(jié)果為鹿茸快速生長(zhǎng)及骨化機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

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