亞洲象糞便中產(chǎn)酸克雷伯菌分離鑒定及致病性研究

2018-06-26 07:56曾邦權(quán)李維芬代飛燕

野生動物學(xué)報 2018年2期

周浪曾邦權(quán) 李娟王研李維芬代飛燕*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201;2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201;3.云南省昆明市瀕危動植物收容拯救中心，昆明，651700)

亞洲象(Elephas maximus)屬于國家Ⅰ級重點保護野生動物，被國際自然和自然資源保護聯(lián)盟(IUCN)列為瀕危物種［1］。所以大象的保護和疾病監(jiān)測就顯得尤為重要，至今有文獻記載的大象腸道菌群的研究并不多見，可以為大象疾病診斷提供的依據(jù)遠遠不足，本實驗通過對該發(fā)病大象糞便病菌的分離和鑒定及對糞便中產(chǎn)酸克雷伯菌的致病性探究，初步了解大象消化道微生物菌群的結(jié)構(gòu)，以及其與大象健康的關(guān)系?？蔀槠浼膊≡\斷提供科學(xué)依據(jù)，更是為以后的大象疾病檢測增加素材和提供一定的臨床指導(dǎo)。

克雷伯菌屬(Klebsiella)有5種，分別為產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、植生克雷伯菌(K.planticola)、土生克雷伯菌(K.terrigena)和變形克雷伯菌(K.preteus)，后兩個種屬對人一般不致?。?］，產(chǎn)酸克雷伯菌是抗生素相關(guān)性出血性結(jié)腸炎的一種病原體。產(chǎn)酸克雷伯菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬，生物學(xué)特征不同于其他克雷伯氏菌種，是重要的條件致病菌，在植物和水生環(huán)境中都能檢出，也存在于人和動物的腸道，導(dǎo)致人畜共患病［3］。

1 材料

1.1 試驗材料

本試驗實驗動物:亞洲象，43歲，雌性。所用病料為無菌采取的該患病大象新鮮糞便樣品1份，病料來源于云南省昆明市某一公園。

1.2 主要試劑與設(shè)備

麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、DNA提取試劑盒、核酸染色劑、電熱恒溫培養(yǎng)、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、光學(xué)顯微鏡。

1.3 實驗動物

昆明SPF小白鼠，6周齡，體重20～25 g，購于云南省昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物培育中心。

2 方法

2.1 細菌的接種培養(yǎng)

細菌普通培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)或具有溶血環(huán)的菌落分別接種于選擇、鑒別培養(yǎng)基上，進行選擇鑒別培養(yǎng)，然后再挑取這些不同形態(tài)特征或具有溶血環(huán)的菌落分別混勻于裝有2～3 mL肉湯培養(yǎng)液的4 mL離心管中，放入37℃恒溫搖床培養(yǎng)箱中進行細菌的擴增培養(yǎng)［4］。該實驗共挑選了5種不同形態(tài)特征的菌落進行下一步實驗，編號為①②③④⑤。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

涂片、干燥、初染、煤染、脫色、復(fù)染、水洗。把制作好的載玻片放在顯微鏡上，觀察其菌落形態(tài)及菌體的顏色。

2.3 生化試驗

分別挑取菌落形態(tài)與大腸桿菌(Escherichia coli)和產(chǎn)酸克雷伯菌相似的細菌，根據(jù)查閱相關(guān)材料獲得大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯菌常規(guī)生化試驗相符的生化試驗微量發(fā)酵管，將其分別接種于其中。試驗結(jié)果見表1。

表1 革蘭氏陰性桿菌生化試驗結(jié)果Tab.1 Gram－negative bacilli biochemical test results

表2 革蘭氏陽性桿菌生化試驗結(jié)果Tab.2 Gram-positive bacilli biochemical test results

2.4 PCR擴增與測序

待測細菌DNA的提取;細菌DNA擴增體系配制;細菌檢測PCR反應(yīng);凝膠電泳觀察(PCR擴增產(chǎn)物電泳);測序鑒定;測序結(jié)果在NCBI上進行序列比對分析，進一步確定所分離到細菌的種屬。

2.5 藥敏試驗

將分離純化得到的菌株進行藥敏試驗，用移液槍吸取0.2 mL的菌液于普通瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的三角玻璃棒均勻涂布接種，接種平板后，根據(jù)鏡檢結(jié)果選擇針對革蘭氏陰性菌窄譜、藥物作用性強、不良反應(yīng)少且臨床上常用的10種藥片進行貼片，貼上紙片15 min內(nèi)，須把平板放在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，并用直尺測量其直徑［5－6］，結(jié)果見表 3。

2.6 動物回歸實驗

取純化后的產(chǎn)酸克雷伯菌菌液吸取0.5 mL至裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，置于37℃的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h后，取培養(yǎng)后的菌液0.1 mL到裝有0.9 mL的無菌生理鹽水的試管中充分混勻，進行10倍稀釋，再從稀釋后的菌液中去0.1 mL到另一管裝有0.9 mL的生理鹽水中，混勻，以此類推，直至稀釋到1∶1013，共稀釋13個梯度，然后從最后2個梯度的試管中分別吸取0.1 mL到事先高壓好的普通營養(yǎng)瓊脂平板上，每個梯度涂3個平板，用無菌三角棒進行全面涂板接種，正向放置10～15 min后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后進行平板計數(shù)，計數(shù)時求其平均數(shù)。計算公式為:每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10(注意:濃度從大到小所乘倍數(shù)依次減小10倍)［7］。然后根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果將其稀釋到2.5×1012cfu/mL進行致病性試驗，以0.5 mL/只的劑量經(jīng)腹腔注射給5只小鼠，作為實驗組，另外設(shè)5只作為對照組，對照組每只注射0.5 mL的生理鹽水，觀察小鼠情況。將稀釋到2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL、2.5×1013cfu/mL的菌液進行細菌毒力試驗，取36只小白鼠隨機分為6個小組，分為5個實驗組和1個對照組，每組6只小鼠，實驗組每只小鼠注射0.5 mL的稀釋菌液，對照組每只注射0.5 mL的生理鹽水，進行腹腔注射，試驗組和對照組分別隔離飼養(yǎng)，觀察一周內(nèi)小鼠的情況。

2.7 病理檢查

對實驗組死亡小鼠進行解剖，在無菌的條件下采取病變嚴(yán)重部位于甲醛溶液中，送至云南省第一人民醫(yī)院進行病理切片的制作，然后對病理結(jié)果進行總結(jié)分析。

2.8 目的菌的回收與鑒定

將死亡的小鼠進行解剖，取病變較為明顯的腸道和肝臟組織進行實驗室細菌分離鑒定培養(yǎng)和測序鑒定。

2.9 治療方案

根據(jù)臨床癥狀以及綜合藥敏結(jié)果建立的治療方案如下:

① 頭孢賽肟鈉1 g/支 ×20;5%葡萄糖鹽水500 mL×6瓶。

②10%葡萄糖 500 mL/瓶 ×6;10%NaHCO310 mL/支 ×15。

③5%葡萄糖500 mL/瓶 ×4;肌苷5 mL/支 ×2盒;輔酶A(100單位)×2盒;

ATP(三磷酸腺苷)2 mL/支×2盒。

④5%葡萄糖500 mL/瓶×3;維生素C 2 mL/支×5盒。

⑤ 痛立止10 mL/支×50支，共500 mL，分點肌肉注射。

3 結(jié)果

3.1 細菌接種培養(yǎng)結(jié)果

37℃培養(yǎng)18～24 h在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上得到2種菌落:一種在普通營養(yǎng)瓊脂上形成圓形突起、光滑、濕潤、半透明、灰白色、邊緣整齊的，中等偏大的菌落，直徑在2～3 mm之間;在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落;在SS培養(yǎng)基上和在麥康凱培養(yǎng)基上均形成紅色菌落，但在SS培養(yǎng)基上生長比較貧瘠;在血平板上形成溶血環(huán)。另一種在普通營養(yǎng)瓊脂上形成較大、凸起、灰白色黏液型的菌落，菌落大而厚實、光亮，相鄰菌落容易發(fā)生融合，用接種針蘸取時可挑出長絲狀細絲;在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成較大、黏稠、紅色、易融合成一片的菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色黏稠菌落;在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落;在血平板上形成灰白色、大而黏、光亮形成黏絲菌落(鏡檢圖片見附件)。

3.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

鏡檢觀察到2類細菌形態(tài):一類為呈革蘭氏陰性無芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，多散在，少成對(①、②管);另一類也為革蘭氏陰性菌，但呈單個或成對，是具有莢膜無芽抱的粗短桿菌(③、④、⑤管)。細菌鏡檢圖片見附件。

3.3 生化試驗結(jié)果

能夠分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;吲哚(I)和甲基紅(M)試驗都為陽性、VP(v)及枸椽酸鹽利用(C)都為陰性;氧化酶試驗為陰性;不分解甘露醇。理化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］，發(fā)現(xiàn)分離到的菌種與大腸桿菌常規(guī)生化反應(yīng)相符。

分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣;靛基質(zhì)反應(yīng)陽性;甲基紅陰性;利用枸椽酸鹽和丙二酸鹽;賴氨酸反應(yīng)陽性;吲哚反應(yīng)陽性;鳥氨酸脫氫酶反應(yīng)陰性。理化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］，發(fā)現(xiàn)分離到的菌種與產(chǎn)酸克雷伯菌常規(guī)生化反應(yīng)相符。

3.4 PCR擴增與測序結(jié)果

采用設(shè)計的引物，以細菌核酸DNA為模板進行PCR擴增試驗，結(jié)果擴增出與目的片段大小一致的DNA片段(圖1)，獲得核酸片段大小為1500 bp左右。送擴增的菌液至生物公司進行測序，在NCBI上比對后，發(fā)現(xiàn)所獲得3種細菌，分別與大腸桿菌O83∶H1、大腸桿菌 O104∶H4和產(chǎn)酸克雷伯菌具有99%的同源性，可判定所測菌株①為大腸桿菌O83:H1、②為大腸桿菌O104:H4和③、④、⑤為產(chǎn)酸克雷伯菌(堿基序列見附件)。

圖1 細菌PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Bacterial PCR products of agar gel electrophoresis

3.5 藥敏試驗結(jié)果

表3 細菌藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Bacterial susceptibility test results

由表3可知:該細菌對氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢賽肟鈉、環(huán)丙沙星、卡那霉素、磺胺異亞唑等極度敏感;對阿莫西林、多粘菌素B等高度敏感;對萬古霉素等中度敏感;對甲氧嘧啶耐藥。

3.6 動物回歸實驗

3.6.1 細菌計數(shù)結(jié)果

經(jīng)18 h、37℃恒溫培養(yǎng)后，第12個細菌稀釋梯度所涂3個板長出的細菌菌落平均個數(shù)為300個左右，第13個細菌稀釋梯度所涂3個板所出的細菌菌落平均個數(shù)為200個左右，因此這2個梯度的菌液濃度為2.0×103cfu/mL和3.0×103cfu/mL，可推斷該菌原液濃度大約在2.0×1016～3.0×1016cfu/mL，所以將各個梯度的濃度定為2.5×1016cfu/mL、2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL……2.5×104cfu/mL、2.5×103cfu/mL、2.5×102cfu/mL。

3.6.2 動物回歸試驗結(jié)果

根據(jù)細胞計數(shù)和查閱文獻，選擇用3個梯度濃度的菌液分別注射給3個實驗組的小鼠，每組的cfu值分別為:第一組:2.5×1015cfu/mL，第二組:2.5×1014cfu/mL，第三組:2.5×1013cfu/mL。實驗小鼠在不同時間發(fā)生發(fā)病和死亡現(xiàn)象，第一組接種菌液后12 h開始發(fā)病，出現(xiàn)精神萎靡，眼部分泌物增多;14 h出現(xiàn)失明現(xiàn)象;16 h出現(xiàn)呼吸急促;24 h出現(xiàn)2只死亡;36 h出現(xiàn)第3只死亡;2 d后試驗組6只小鼠全部死亡。第二組和第三組小鼠接種后24 h開始出現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)的臨床癥狀比第一組輕，1 d后出現(xiàn)死亡，4 d后實驗小組全部死亡。將死亡的小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔有黏稠的液體;胃壁增厚、腫大;部分腸管擴張，內(nèi)有大量黃色黏液;肝臟部分壞死;脾臟出血;心臟肺臟出血。根據(jù)解剖癥狀，采取了小鼠的腸道、肝臟肺臟進行了鑒別培養(yǎng)和測序鑒定，結(jié)果是所檢測樣品全都為產(chǎn)酸克雷伯菌(解剖圖片見附件)。

3.6.3 毒力性試驗結(jié)果

每組小鼠在注射0.5 mL不同梯度菌液后，不同梯度菌液注射的小鼠出現(xiàn)在不同的時間發(fā)病或死亡現(xiàn)象。根據(jù)各組小鼠死亡情況，計算出最小致死量(MLD)，依照寇氏改良法計算公式:LD50=log－1［Xm－i(Pm－0.5)］(Xm代表最大劑量的對數(shù);i代表組距，即相鄰2個組對數(shù)差;Pm代表各組死亡率之和)計算出半數(shù)致死量(LD50)［10］結(jié)果表明。

表4 感染克雷伯菌小鼠的死亡情況Tab.4 Deaths of infected Klebsiella mice

表5 致死量測定結(jié)果Tab.5 Lethality measurement results

3.7 病理檢查結(jié)果

圖2 腸壁(100×)Fig.2 Bowel wall(100×)

圖3 肺部(100×)Fig.3 Pulmonary(100×)

肺部(200×)Pulmonary(200×)

圖4 肝臟(100×)Fig.4 Liver(100×)

肝臟(200×)Liver(200×)

圖5 心臟(200×)Fig.5 Heart(200×)

心臟(400×)Heart(400×)

由以上組織切片結(jié)果可知:小鼠主要病變部位變化為腸壁部分黏膜自溶，慢性炎細胞浸潤;肺局灶血管旁少量炎細胞散在浸潤;肝細胞濁腫，可見雙核和核大肝細胞;心臟充血，局灶心肌纖維變性?？梢娦∈蟛±碜兓饕匝仔苑磻?yīng)為主，引起腫大充血和變性。

3.8 目的菌回收結(jié)果

將實驗過程中死亡的實驗組小鼠進行解剖，取腸道和肝臟所分離到的細菌，鑒別培養(yǎng)后進行純化擴增，送擴增的菌液至生物公司進行測序，在NCBI上比對后，確定其就是產(chǎn)酸克雷伯菌，說明實驗組小鼠死亡是由產(chǎn)酸克雷伯菌感染引起的。

3.9 治療結(jié)果

經(jīng)過提出的治療方案進行了為期一周的治療，最后該患病大象基本恢復(fù)正常。

4 討論與分析

該大象在此之前一直有做定期細菌檢測，在之前的記錄中，其糞便中都存在有大腸桿菌O83∶H1和大腸桿菌O104∶H4等這些常見致病菌，但是該大象之前并未出現(xiàn)便血癥狀，所以本次實驗主要以產(chǎn)酸克雷伯菌的分離鑒定及其致病試驗研究展開的。

從死亡小鼠解剖結(jié)果來看，產(chǎn)酸克雷伯菌侵害的部位主要是腸道、肝臟和肺臟，主要表現(xiàn)為腸道水腫，內(nèi)有大量黃色黏液;肺部點狀出血和肝臟部分壞死。用前3個梯度濃度的菌液注射的小鼠，在接種后的48 h內(nèi)全部死亡，其他梯度濃度的菌液所注射的小鼠都表現(xiàn)出了輕微或嚴(yán)重的臨床癥狀，最后均發(fā)生死亡，說明該菌對小鼠易感且致病性較強，這跟Bleich等［11］和 Foreman 等［12］的研究是具有一致性的。

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附件:

細菌分離鑒定結(jié)果圖片