陳 頎 白加德 李俊芳 李夷平 張樹苗

(北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，北京，100076)

麋鹿(Elaphurus davidianus)是中國特有的瀕危物種，是國家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，IUCN紅色名錄列為“野生滅絕”，20世紀(jì)初曾在中國本土滅絕。1985年在我國進(jìn)行了重引入工作，現(xiàn)有麋鹿6000頭左右，是世界上僅存18頭麋鹿的后裔，面臨著嚴(yán)重的近親交配問題［1］。通過麋鹿精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，有利于提高人工授精的成功率，利用麋鹿人工授精，建立麋鹿種質(zhì)資源庫，提高麋鹿血統(tǒng)改良的效率，遏制麋鹿遺傳多樣性的退化趨勢(shì)。

精子超微結(jié)構(gòu)研究是檢驗(yàn)精液品質(zhì)，揭示精子發(fā)生機(jī)制，開展受精生物學(xué)研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容［2］。精子的品質(zhì)直接影響精子的穿卵能力和母體的受孕率［3－5］，麋鹿精子形態(tài)的掃描電鏡觀察尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)使用掃描電鏡對(duì)12頭處于繁殖季節(jié)的麋鹿的精子進(jìn)行形態(tài)觀察，觀察其表面的結(jié)構(gòu)，闡明麋鹿精子的超微結(jié)構(gòu)。對(duì)研究麋鹿授精機(jī)理、繁殖和種質(zhì)資源的保存［6－7］，特別是利用人工授精技術(shù)保護(hù)瀕危物種的應(yīng)用具有重要意義［8］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 精子標(biāo)本

2016年6～8月，在麋鹿發(fā)情期，選擇發(fā)情旺盛雄鹿12頭，利用DZCJ-3型電刺激采精儀，對(duì)麋鹿進(jìn)行電刺激采精，取得新鮮精液，通過顯微鏡進(jìn)行鏡檢，選用精子活動(dòng)率大于50%的標(biāo)本12例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器耗材

DZCJ-3型電刺激采精儀，HCP-2臨界點(diǎn)干燥器，SANYO烘箱，IB-5離子濺射儀，eppendorf離心機(jī)，Quanta 200掃描電鏡，JEE-420真空噴鍍儀，離心管，樣品托，銀導(dǎo)電膠，眼科鑷子，青霉素小瓶，培養(yǎng)皿，載玻片，牙簽，脫脂棉等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

0.25%～1%低濃度戊二醛、2.5%戊二醛(由戊二醛化學(xué)純配制)、1%鋨酸，丙酮(化學(xué)純)、無水乙醇(化學(xué)純)、醋酸異戊酯(化學(xué)純)、雙蒸水，0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液、液體二氧化碳、導(dǎo)電膠等。

1.2 方法

參照人精子掃描電鏡樣本制備方法［9－10］:于精液標(biāo)本中加入濃度為0.25%的戊二醛，預(yù)固定15 min，使精子細(xì)胞保持形狀，然后使用低濃度(0.25%～1%)戊二醛固定2 h以上，將精液經(jīng)2000 r/min，離心10 min，棄去上清液，輕輕加入2.5%的戊二醛，用吹管輕輕吹打，使細(xì)胞分散;然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3次，每次5 min，50%、70%、90%乙醇梯度脫水，各1次，每次8 min;100%乙醇脫水3次，每次5 min，醋酸異戊脂置換3次，每次5 min;CO2臨界點(diǎn)干燥;金屬鍍膜;掃描電鏡(Quanta 200)觀察。

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)檢查

由表1可知，對(duì)雄性麋鹿電刺激采精12頭次，成功12次，電刺激采精成功率100%，采精量為0.5～2 mL，麋鹿每次射精量平均體積(1.07±0.58)mL，精子的平均密度(10.23±2.77)×108/mL，平均精子活力(0.76±0.09)，72 h鮮精活力(0.62±0.12)，精液品質(zhì)良好，精液經(jīng)稀釋液稀釋后72 h，鮮精活力達(dá)到0.6以上。

該技術(shù)可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過多次電刺激采精，采精成功率都很高，采集的精液量充足而且質(zhì)量很高。

表1 麋鹿電刺激采精結(jié)果Tab.1 The result of electro-ejaculation from Père David's deer

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 正常精子形態(tài)

通過掃描電鏡，可以觀察到麋鹿完整的精子，其外形為細(xì)長(zhǎng)圓柱狀。在掃描電鏡下觀察，麋鹿精子和其他哺乳動(dòng)物相同，屬于典型的鞭毛精子，精子總長(zhǎng)約41 μm。由頭、頸、尾部構(gòu)成，表面光滑。精子頭部呈梨形，長(zhǎng)約6.4 μm，寬約4 μm(圖1)。大部分為精核，精核的電子密度較高，且為濃縮狀。精核的前端較為膨大的部分為頂體，頂體約占頭部的三分之二。連接頭部和尾部的很短的區(qū)域?yàn)榫拥念i部，細(xì)長(zhǎng)的部分為精子的尾部，是精子代謝和運(yùn)動(dòng)的器官，可分為中段、主段和終段，在和頸部相連接處驟然變細(xì)。在掃描電鏡下很難區(qū)別赤道帶，可表現(xiàn)為頂體后溝增寬或位于頭的最厚部分而不顯凹陷。

2.2.2 畸形精子形態(tài)

正常形態(tài)精子的頭部呈梨形，頂體區(qū)較光滑，頸部沒有胞質(zhì)殘余，尾部可清楚地分為中段、主段和尾段［5，10］，本實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡觀察到了頂體破裂、頸部破裂、頸部膨大、主段膨大等形態(tài)改變的畸形精子，從圖2～圖5可以看出精子的頭部(頂體)、頸部和尾部(主段)均發(fā)生了超微形態(tài)異常。

圖1 正常麋鹿精子的形態(tài)(2000×)Fig.1 The normal morphology of Père David's deer's sperms(2000×)

圖2 頂體破裂的精子(5000×)Fig.2 Sperms with rupture of the acrosome(5000×)

圖3 頸部斷裂的精子(5000×)Fig.3 Sperms with rupture of the neck(5000×)

圖4 頸部膨大的精子(3000×)Fig.4 Sperms with enlargement of the neck(3000×)

圖5 主段膨大的精子(5000×)Fig.5 Sperms with enlargement of the principal piece(5000×)

3 討論

3.1 麋鹿電刺激采精結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)5只雄性麋鹿進(jìn)行了6次電刺激采精試驗(yàn)，均取得了成功，采精技術(shù)成熟，電刺激采精成功率100%［8］。分別于6月［1］和9月對(duì)12頭雄性麋鹿進(jìn)行電刺激采精，多數(shù)采精量大于1.2 mL，精子活力大于0.6。通過表2可以看出麋鹿每次射精量平均體積、精子的平均密度、平均精子活力、72 h鮮精活力均沒有顯著變化。對(duì)9月采集精子進(jìn)行掃描電鏡觀察，可以觀察到正常精子形態(tài)和部分畸形精子形態(tài)。

表2 2次麋鹿電刺激采精結(jié)果對(duì)比Tab.2 The result of electro－ ejaculation from Père David's deer

3.2 麋鹿精子結(jié)構(gòu)

與梅花鹿(Cervus nippon)［3］等哺乳動(dòng)物精子結(jié)構(gòu)相似，麋鹿精子具有膨大的頂體前端，其內(nèi)儲(chǔ)存著大量的頂體反應(yīng)所需的多種酶類，以利于受精時(shí)精子穿透卵子。其頸段較長(zhǎng)，可儲(chǔ)存用于精子運(yùn)動(dòng)的大量能量。

3.3 精子樣品的制備

一個(gè)合格的掃描電鏡樣品應(yīng)該能觀察到飽滿的精子細(xì)胞、精子表面結(jié)構(gòu)清晰而且無雜物，這就需要關(guān)注實(shí)驗(yàn)的漂洗、固定、脫水和干燥等環(huán)節(jié)。合適的實(shí)驗(yàn)條件下，可以觀察到正常麋鹿精子頭部呈梨形。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)條件下，會(huì)觀察到不同形態(tài)的畸形改變，電鏡下精子頭部明顯皺縮，呈扁片狀，可能原因有:(1)制樣過程中脫水時(shí)間過長(zhǎng)。由于水的表面具有張力，脫水時(shí)間長(zhǎng)會(huì)使樣品受到脫水張力的損傷，發(fā)生收縮和變形［11］。(2)臨界點(diǎn)干燥不徹底。過渡液醋酸異戊酯與CO2混合后被排盡，去除臨界狀態(tài)下細(xì)胞表面張力，從而形成飽滿的形態(tài)［9］，這步臨界點(diǎn)干燥是決定樣品質(zhì)量的關(guān)鍵一步，如果干燥不徹底就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞黏合成團(tuán)［12］，不能顯示完成的形態(tài)。因此在制備精子樣品時(shí)，需要注意實(shí)驗(yàn)操作。

3.4 精子畸形的部位及原因分析

正常精子標(biāo)本中可能都有些老、弱、病、殘的精子，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行電鏡觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)精子頭部、頸部開裂較多見，而尾部中間斷裂較少。推測(cè)是因?yàn)?(1)精子是特化細(xì)胞，它的頭部和頸部是儲(chǔ)存能量的部位，結(jié)構(gòu)較脆弱，制備過程中耐受性比較差，容易破裂或者斷裂，造成畸形。(2)精子頭部、頸部和尾部的結(jié)構(gòu)和含水量各不相同［13］。而精子尾部含水量相對(duì)較多，因此不容易發(fā)生斷裂或開裂現(xiàn)象。

3.5 精子結(jié)構(gòu)研究展望

精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相對(duì)應(yīng)，具備正常的受精能力的精子必須具備完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)［14］，畸形的精子受精能力下降明顯。因此在本研究的基礎(chǔ)上，開展對(duì)麋鹿精液冷凍保存等研究，進(jìn)一步分析冷凍精液的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，構(gòu)建麋鹿冷凍精子庫，應(yīng)用于麋鹿人工授精，可以有效遏制麋鹿遺傳多樣性的降低，有效保護(hù)麋鹿這一珍稀物種。

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