袁昕慧 金海峰 袁慧艷 鞠 銘 王 妍

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，延吉，133000)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的多發(fā)于幼犬的高致死性傳染病，主要表現(xiàn)為出血性腸炎和心肌炎［1］。1982年，梁士哲等［2］首次報(bào)道了類似CPV所致的犬出血性腸炎，隨后此病在我國(guó)大范圍內(nèi)蔓延開來，并已分離到多株病毒株。該病多呈地方性流行，雖無明顯的季節(jié)性，但以冬春季多發(fā)［3］。最初認(rèn)為 CPV主要感染犬科動(dòng)物，但由于CPV變異速度快，最早的CPV－2在出現(xiàn)后短短幾年時(shí)間發(fā)生抗原漂移，在抗原性、宿主范圍和血凝性方面均發(fā)生了變化。在對(duì)多種野生動(dòng)物貓泛白細(xì)胞減少癥(FPV)基因型調(diào)查中，已證實(shí)它的變異型CPV－2a/2b在自然條件下也能感染貓科(Felidae)、鼬科(Mustelidae)等多種肉食獸，其危害不容忽視［4－6］。本試驗(yàn)為了解 CPV在黑熊中的流行情況，從延吉熊場(chǎng)臨床采集數(shù)份疑似 CPV感染血清樣品，用ELISA法對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在為延邊地區(qū)黑熊養(yǎng)殖業(yè)中細(xì)小病毒的流行情況進(jìn)行初步分析，并有助于及時(shí)診斷和做好防治措施。

1 材料與方法

1.1 材料

血液采于延吉某兩個(gè)熊場(chǎng)，犬細(xì)小病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海潤(rùn)裕試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品與處理

無菌采集血液，加入適量肝素，制成抗凝血。3000轉(zhuǎn)離心30 min后取上清。

1.2.2 犬細(xì)小病毒抗體檢測(cè)方法

經(jīng)離心處理過的樣品上清使用犬細(xì)小病毒抗體ELISA試劑盒根據(jù)使用說明書進(jìn)行具體操作。

①?gòu)氖覝仄胶?0 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃;

②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;

③待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液 40 μL;

④隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗原100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min;

⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板);

⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min;

⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.2.3 ELISA陰、陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)

臨界值計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔值+0.15。陽(yáng)性判斷:樣品OD值＞臨界值，樣品為陽(yáng)性。陰性判斷:樣品OD值＜臨界值，樣品為陰性。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)ELISA法檢測(cè)49份黑熊血液樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示:共檢出陽(yáng)性樣品27份(表1)熊的CPV抗體陽(yáng)性率為55.1%，表明CPV在東北黑熊中較為流行。

3 討論

犬細(xì)小病毒病是犬的一種重要傳染病，其流行使養(yǎng)犬業(yè)損失巨大，同時(shí)也對(duì)野生動(dòng)物活動(dòng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。迄今為止，CPV只有一個(gè)抗原型，即CPV-2，但不同毒株間抗原性有所差異，而且已出現(xiàn)了多個(gè)亞型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和 CPV2c(b)。CPV-2型出現(xiàn)后很快世界廣泛傳播，連續(xù)傳播幾年后，已經(jīng)發(fā)生抗原漂移，在抗原性、宿主范圍和血凝性上都發(fā)生了變化［7］。最初的主要感染犬科動(dòng)物變得也能感染貓、幼熊、貂(Martes spp．)等動(dòng)物。由于ELISA法在檢測(cè)CPV抗體方面具有特異性高，成本低廉，操縱簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)主要利用雙抗原夾心ELISA法來檢測(cè)CPV在黑熊中的流行情況，49份黑熊血液樣品中有27份呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.1%。本項(xiàng)研究為以后熊的細(xì)小病毒感染的預(yù)防與控制提供了重要的參考。

表1 ELISA法檢測(cè)黑熊血清樣品結(jié)果Tab.1 Results of black bear serum sample by Elisa

［1］ 王居平，吳玄光，向瑞平，等．犬細(xì)小病毒病的診斷技術(shù)［J］．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26(4):316－320．

［2］ 梁士哲，魏喜仁，范文光，等．狗傳染性腸炎的研究1、腹瀉狗糞便中檢出的細(xì)小病毒樣顆粒［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，1982，2(4):172－175．

［3］ 孔繁德，陸承平．犬細(xì)小病毒病原特性的研究概況 ［J］．中國(guó)獸醫(yī)科技，1995，25(1):18－19．

［4］ Parrish C R，Aquadro C F，Strassheim M L，et al．Rapid antigenic－type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus［J］．Journal of Virology，1991，65(12):6544 －6552．

［5］ Parrish C R，O'Connell P H，Evermann J F，et al．Natural variation of canine parvovirus［J］．Science，1985，230(4729):1046 －1048．

［6］ Truyen U，Agbandje M，Parrish C R．Characterization of the feline host range and a specific epitope of feline panleukopenia virus［J］．Virology，1994，200(2):494－503．

［7］ 李河林，焦鐵軍，劉淑紅，等．犬細(xì)小病毒病研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(5):73－77．