唐　軍，孫萌萌，徐艷峰，占玲俊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)計(jì)委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100021)

腫瘤壞死因子(TNF-α)是在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等慢性炎癥性疾病致病機(jī)制中起主要作用的一種促炎性因子。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的臨床治療上，英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗等TNF-α抑制劑是療效最為顯著的一類藥物。但這些藥物的使用也會(huì)帶來一些風(fēng)險(xiǎn)，在治療中需要特別注意。比如患者發(fā)生嚴(yán)重感染和其他機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，包括結(jié)核分枝桿菌、單增李斯特菌等引起的感染[1-2]。在對(duì)這一類藥物及其仿制藥進(jìn)行臨床前研究的時(shí)候，有必要對(duì)這些潛在的不良反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估[3]。作為一種在自然環(huán)境中分布廣泛的致病菌，單增李斯特菌往往對(duì)免疫功能低下的人群如新生兒、孕婦和免疫功能缺陷者等造成威脅[4]。我們通過建立一種單增李斯特菌感染的TNF-α人源化小鼠模型，為評(píng)價(jià)TNF-α單抗類藥物治療引起的單增李斯特菌感染風(fēng)險(xiǎn)提供了一種研究模式，并應(yīng)用該模型對(duì)阿達(dá)木單抗進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用TNF-α人源化小鼠12只，購于百奧賽圖公司[SCXK(京)2015-0008]，是將C57BL/6小鼠17號(hào)染色體上Tnf基因用人TNF基因進(jìn)行原位替換，從而使人TNF基因在該品系小鼠上表達(dá)。野生型C57BL/6，6只，購于維通利華公司[SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF級(jí)，雌性，14周齡，體重22～24 g。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SYXK(京)2015-0035]ABSL-2實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-PL-2015-014。

1.2　實(shí)驗(yàn)材料

單核增生李斯特菌，編號(hào)1.10753(ATCC編號(hào)19115)，來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；阿達(dá)木單抗(adalimumab)，艾伯維公司；PALCAM選擇性培養(yǎng)基(CM509 A)，購自北京陸橋；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯TSB-YE(CM501 A)，購自北京陸橋。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌液制備和動(dòng)物感染

向菌種安瓿瓶中加入0.5 mL TSB-YE培養(yǎng)基，充分溶解后全部加入7 mL TSB-YE培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。復(fù)蘇增菌兩次后，進(jìn)行連續(xù)稀釋，然后均勻涂布于PALCAM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌落為淺綠色，中心凹陷，菌落周圍有黑色的水解環(huán)，計(jì)算菌液濃度(CFU/mL)。增菌后的菌液立刻置于4℃保存，動(dòng)物感染時(shí)將原菌液用生理鹽水連續(xù)稀釋一定比例后取200 μL進(jìn)行腹腔注射。注射所用菌液再次涂布平皿，培養(yǎng)計(jì)數(shù)后對(duì)接種菌量進(jìn)行修正，實(shí)際注射量為每只1×104CFU。

1.3.2動(dòng)物分組

動(dòng)物分為三組，每組6只：野生型C57BL/6小鼠感染對(duì)照組；TNF-α人源化小鼠感染對(duì)照組；TNF-α人源化小鼠adalimumab組。對(duì)照組小鼠感染前24 h 靜脈注射生理鹽水200 μL，adalimumab組小鼠則按照10 mg/kg在感染前24 h靜脈注射阿達(dá)木單抗200 μL。

1.3.3檢測(cè)及分析方法

小鼠感染1 d(n=3)及4 d(n=3)后進(jìn)行解剖，取肝及脾組織。一部分進(jìn)行組織勻漿后，連續(xù)稀釋并均勻涂布于PALCAM平板上，培養(yǎng)24～48 h。計(jì)數(shù)并計(jì)算組織荷菌量。另一部分置于10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋后切片進(jìn)行病理檢測(cè)。蘇木素-伊紅(HE)染色：切片脫蠟，經(jīng)蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，氨水反藍(lán)后伊紅染色，脫水透明封片，然后觀察組織相應(yīng)的病理變化。免疫組織化學(xué)染色：組織切片脫蠟，使用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉后加一抗Listeriamonocytogenesantibody(ab35132，Abcam)、F4/80 antibody(565409，BD)、TNF-α antibody(ab9635，Abcam)、CD45R antibody(550286，BD)，4℃過夜后加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后沖洗，脫水透明封片。切片經(jīng)濱松NanoZoomer S60進(jìn)行數(shù)字掃描后，使用NDP軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　病理HE染色

感染后第1天，各組脾組織的病理變化不明顯，肝組織均出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，無其他特異性病變，但各組間差異無顯著性(圖1)。肝的病理改變表明單增李斯特菌已經(jīng)侵襲進(jìn)入這一重要的靶器官，并造成了一定的病理損傷。但在這一時(shí)間點(diǎn)病變較為輕微，尚不典型，各組間差異不明顯，沒有觀察到adalimumab干預(yù)對(duì)疾病的早期影響。

注：(1)野生型小鼠對(duì)照組；(2)TNF-α人源化小鼠對(duì)照組；(3)TNF-α人源化小鼠adalimumab干預(yù)組。圖1　感染1 d后組織病理變化情況(×10)Note. (1) A WT control mouse. (2) A control TNF-α mouse. (3) A TNF-α mouse injected with adalimumab.Fig.1　Pathological changes of the mouse liver and spleen at one day after infection

感染后第4天，各組肝組織均出現(xiàn)明顯的病理變化，為肝細(xì)胞壞死伴隨炎性細(xì)胞浸潤，且各組之間存在顯著差異。這種廣泛分布的微膿腫病變是李斯特菌病的一種典型病理表現(xiàn)，其數(shù)量和大小反映了疾病的嚴(yán)重程度。如圖2A所示，野生型組C57BL/6小鼠肝中出現(xiàn)點(diǎn)狀的微膿腫，數(shù)量較少且面積小。TNF-α人源化小鼠對(duì)照組表現(xiàn)與野生型組類似，而adalimumab組則表現(xiàn)為面積較大且數(shù)量較多的微膿腫。我們統(tǒng)計(jì)了每只小鼠肝數(shù)字化切片中全部微膿腫的數(shù)量和大小，如圖2B所示。各組間比較發(fā)現(xiàn)adalimumab組中微膿腫半徑顯著大于TNF-α人源化小鼠對(duì)照組及野生型組對(duì)照(圖2C)。這表明adalimumab干預(yù)顯著加重了單增李斯特菌感染小鼠的肝臟病理損傷。

2.2　組織荷菌量

感染后第4天，取各組動(dòng)物肝和脾，稱重后測(cè)定其單增李斯特菌的荷菌量。結(jié)果顯示，人源化TNF-α小鼠在肝脾組織中的荷菌量與野生型C57BL/6小鼠差異沒有顯著性。而adalimumab組的小鼠在以上兩種組織中的荷菌量均顯著高于野生型對(duì)照組和TNF-α人源化小鼠組(圖3)。

從病理變化和組織荷菌量的差異，可以看出TNF-α對(duì)于宿主抵抗單增李斯特菌的免疫具有重要作用，TNF-α單抗干預(yù)后宿主疾病進(jìn)展顯著加重。此外，人TNF-α替代小鼠TNF-α之后，沒有對(duì)宿主抵抗李斯特菌的免疫產(chǎn)生顯著性的影響。

2.3　免疫組化分析

為了觀察TNF-α受抗體阻斷后，對(duì)各類免疫細(xì)胞在感染位點(diǎn)分布的影響，進(jìn)一步檢測(cè)了組織中F4/80和CD45R[5]的表達(dá)分布情況。與荷菌量檢測(cè)結(jié)果一致，adalimumab組小鼠肝微膿腫內(nèi)可見較多的單增李斯特菌存在。此外，該組病灶及周圍也存在較高水平的TNF-α表達(dá)。通過巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記分子F4/80的分布可見，巨噬細(xì)胞也在微膿腫附近呈聚集分布，TNF-α單抗干預(yù)未對(duì)巨噬細(xì)胞的募集產(chǎn)生顯著影響。在脾內(nèi)，CD45R的表達(dá)分布在各組內(nèi)也未見顯著差異(圖4)。

從以上結(jié)果可見，adalimumab作為在臨床廣泛使用的重要藥物，對(duì)巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等重要免疫細(xì)胞在宿主對(duì)單增李斯特菌感染應(yīng)答時(shí)的分布并未產(chǎn)生顯著干擾。但TNF-α單抗的干預(yù)確實(shí)加重了TNF-α人源化小鼠中單增李斯特菌感染引起的疾病。

3　討論

本研究建立了一種單增李斯特菌感染的TNF-α人源化小鼠模型，并應(yīng)用該模型初步評(píng)價(jià)了阿達(dá)木單抗對(duì)單增李斯特菌感染風(fēng)險(xiǎn)的影響。應(yīng)用阿達(dá)木單抗阻斷體內(nèi)TNF-α作用，加劇了感染單增李斯特菌的TNF-α人源化小鼠的組織病理病變，增加了組織中的荷菌量，這說明TNF-α在宿主抵抗單增李斯特菌感染中起著比較重要的作用，使用TNF-α單抗類藥物將顯著增加患李斯特菌病的風(fēng)險(xiǎn)。

注：(A)HE染色后鏡下各組肝中微膿腫形態(tài)(大圖×10，小圖×40)；(B)各組每只小鼠肝切片中觀察到的微膿腫半徑分布，圖中各點(diǎn)表示單個(gè)微膿腫；(C)各組肝中微膿腫半徑統(tǒng)計(jì)；(1)野生型小鼠對(duì)照組；(2)TNF-α人源化小鼠對(duì)照組；(3)TNF-α人源化小鼠adalimumab干預(yù)組；與野生型小鼠對(duì)照組比較，aP< 0.05；與TNF-α人源化小鼠對(duì)照組比較，bP< 0.05。圖2　感染4天后各組間肝微膿腫差異Note. (A) The morphology of microabscesses in liver tissues after infection. HE staining (×10, ×40). (B) The radius distribution of microabscesses observed in the liver tissues of each mouse. Each spot indicates single microabscess. (C) The median radius and SD of microabscesses in the liver tissues. (1) WT mouse control group. (2) TNF-α mouse control group. (3) TNF-α humanized mouse group injected with adalimumab. Compared with the WT control group,aP< 0.05. Compared with the TNF-α mice control group,bP< 0.05.Fig.2　Comparison of microabscesses in the mouse liver tissues at 4 days after infection

從模型運(yùn)用方面，本研究也初步證明了TNF-α人源化小鼠模型在TNF-α單抗類藥物的臨床前研究中具有比較廣泛的應(yīng)用前景。本研究中使用的阿達(dá)木單抗是臨床應(yīng)用的全人源化單抗，也能與小鼠TNF-α交叉反應(yīng)。但另一種單抗藥物英夫利昔(infliximab)則僅可特異性結(jié)合人TNF-α。對(duì)于英夫利昔及其他新的人TNF-α特異性單抗藥物的相關(guān)研究來說，使用TNF-α人源化小鼠模型是非常必要的。

既保證對(duì)慢性炎癥性疾病的顯著療效，又保留對(duì)機(jī)會(huì)致病菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答能力，是TNF-α拮抗藥物研發(fā)的重要方向。例如，研究跨膜型和分泌型TNF-α在功能上的區(qū)別和聯(lián)系對(duì)于精確調(diào)控宿主免疫具有重要意義，同時(shí)也是更精確的TNF-α拮抗藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)[6-8]。鑒于小鼠TNF-α與人TNF-α功能上的顯著差異[9]，不僅在對(duì)風(fēng)濕性疾病的治療效果上，還有在對(duì)患者發(fā)生機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估上，TNF-α人源化小鼠模型的研究對(duì)TNF-α拮抗藥物研發(fā)都具有重要意義。

注：(1)野生型小鼠對(duì)照組；(2)TNF-α人源化小鼠對(duì)照組；(3)TNF-α人源化小鼠adalimumab干預(yù)組；與野生型小鼠對(duì)照組比較，aP< 0.001；與TNF-α人源化小鼠對(duì)照組比較，bP< 0.01。圖3　感染4 d后各組間組織荷菌量差異Note. (1) WT mouse control group. (2) TNF-α humanized mouse control group. (3) TNF-α mouse injected with adalimumab group. Compared with the WT mouse control group,aP< 0.001. Compared with the TNF-α mouse control group,bP< 0.01.Fig.3　Comparison of bacterial load in the mouse liver and spleen tissues at 4 days after infection

注：(1)野生型小鼠對(duì)照組；(2)TNF-α人源化小鼠對(duì)照組；(3)TNF-α人源化小鼠adalimumab干預(yù)組。圖4　感染4 d后肝和脾微膿腫周圍的改變(免疫組化染色)Note. (1) WT mouse control group. (2) TNF-α humanized mouse control group. (3) TNF-α mouse injected with adalimumab group.Fig.4　Changes of microabscesses in the liver and spleen tissues at 4 days after infection. Immunohisitochemical staining