李笑榮，張進，馬端

復旦大學 基礎醫(yī)學院，上海 200012

PP2A是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是由調(diào)節(jié)亞基 (B)、支架亞基 (A) 和催化亞基(C) 組成的異三聚體，其中調(diào)節(jié)亞基B決定PP2A磷酸酶復合物的底物特異性和亞細胞定位[1-2]。目前在人類細胞中共發(fā)現(xiàn)有12種PP2A調(diào)節(jié)亞基，PPP2R2A是PP2A中調(diào)節(jié)亞基之一[3]。以往的研究表明，PPP2R2A參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促腫瘤細胞生長[4-7]。例如，胰腺癌細胞中 PPP2R2A的表達顯著增加，可激活多條促腫瘤發(fā)生的信號通路 (AKT-，ERK-，Wnt-)[8]；腫瘤細胞中的PPP2R2A/PP2A可催化將c-Jun的T239位點去磷酸化，促進其與 DNA結(jié)合從而促進細胞的增殖和遷移[4]；此外，腫瘤組織谷氨酰胺的缺乏可誘導PPP2R2A表達的上調(diào)，并抑制P53通路，從而促進腫瘤細胞生存[9]。

本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中下調(diào)PPP2R2A后，細胞增殖和遷移的能力顯著下降。由于PPP2R2A是磷酸酶復合物的調(diào)節(jié)亞基，決定了PPP2R2A-PP2A磷酸酶復合物的底物特異性，因此尋找PPP2R2A的相互作用蛋白質(zhì)，有助于闡明 PPP2R2A的作用機制。本研究通過SBP-HIS8串聯(lián)純化分離了PPP2R2A蛋白復合物，進而通過 HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析其蛋白組分。蛋白質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果顯示 PPP2R2A與 GFPT1/GFPT2結(jié)合。GFPT1/GFPT2是己糖胺途徑的限速酶，催化谷氨酰胺水解為谷氨酸，6-磷酸-果糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸-葡萄糖胺。然后經(jīng)一系列反應產(chǎn)生UDP-GlcNAC，而UDP-GlcNAC是蛋白質(zhì)O-連接絲氨酸-蘇氨酸的糖基化修飾以及糖原、糖脂修飾的糖基供體[10-11]。在本研究中，我們將進一步確認 PPP2R2A與 GFPT1/2間的相互作用，以及對GFPT1/2磷酸化和下游蛋白糖基化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞株HEK293T、HEK293和人乳腺癌細胞 MDA-MB-231購自 ATCC；大腸桿菌DH5α由本實驗室擴增提供；慢病毒包裝用輔助質(zhì)粒 (TAT/GAG/VSVG/REC) 購自 SBI公司；Streptavidin-beads購自 GE公司；Protein A/G beads購自 Roche公司；GST beads購自 Sigma公司；單克隆兔源抗 PPP2R2A抗體和單克隆兔源抗GAPDH抗體購自Bioworld公司；單克隆鼠源FLAG抗體購自Abmart；單克隆鼠源 GST抗體和單克隆兔源HA抗體購自Sigma 公司；兔源PKA substrate購自CST公司；Dylight 488以及Dylight 594購于Jackson Immuno Research。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建 PCDH-FLAG3-HIS8-SBP-Puro重組質(zhì)粒，首先設計SBP引物，并添加連續(xù)編碼8個HIS氨基酸序列標，PCR擴增得到目的片段，純化后酶切，與酶切處理的PCDH-FLAG3-Puro質(zhì)粒進行連接，質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化，然后菌落經(jīng)PCR鑒定擴大培養(yǎng)陽性克隆。最后重組質(zhì)粒測序鑒定。重組質(zhì)粒PCDH-FLAG3-hyg-GFPT1/PCDH-FLAG3-hyg-GFPT 2/PCDH-FLAG3-HIS8-SBP-PPP2R2A-Puro/mGSTHIS-GFPT1/mGST-HIS-GFPT2/PCDH-FLAG3-hyg-PP P2R2A以及mGST-HIS-PPP2R2A構(gòu)建方法同上，其中引物如表1所示。

表1 引物名稱和序列Table 1 Primer names and sequences

1.2.2 細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

以HEK293T為慢病毒包裝細胞，按照說明，將4種輔助質(zhì)粒按照和基因表達質(zhì)粒等比例混合即 Rec∶VsVg∶GAG∶TAT∶目標質(zhì)粒=1∶1∶1∶1∶4，脂質(zhì)體 Lipofectamine介導轉(zhuǎn)染，24 h后收集病毒上清，2 000 r/min離心，上清中含有組裝好的慢病毒加入細胞中，同時加入2.5 ng/mL 聚凝胺 (Polybrene) 促進感染，同上分別收集 48 h以及72 h的病毒并感染細胞。最后一次病毒感染48 h后，使用潮霉素加壓篩選細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.3 串聯(lián)親和純化聯(lián)合HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析

收集穩(wěn)定表達 SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A的細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株MDA-MB-231，加入15 mL細胞裂解液 (含1% Triton X-100，1 mol/L巰基乙醇) 冰上裂解20 min，離心收集全部細胞上清。第一次鏈霉柔和素 (Streptavidin) 純化，蛋白上清加入Streptavidin磁珠，4 ℃過夜；棄上清，用細胞裂解液 (含0.1% Triton X-100，1 mol/L巰基乙醇) 洗滌5遍，每次3 min，最后保留1 mL左右含有沉淀復合物混懸液，加入400 μL 生物素洗脫液 (無EDTA/EGTA，含2 mmol/L biotin，20 mmol/L 咪唑)，4 ℃旋轉(zhuǎn)4 h后，收集上清。第二次Ni磁珠純化，蛋白上清加入40 μL PBS平衡后的Ni磁珠，4 ℃旋轉(zhuǎn)2 h；離心棄上清，加入0.05 mmol/L的NH4HCO3(pH 8.0)，4 ℃ 靜置5 min，離心棄上清，重復2次；加入10 mmol/L的NH4HCO3，用2 μg胰酶酶切過夜，取出酶切產(chǎn)物，2 000 r/min離心1 min (4 ℃)，收集上清加入2 μg胰酶繼續(xù)上述酶切4 h (37 ℃)，2 000 r/min離心1 min，收集上清。最后HPLC- Chip-ESI/MS/MS分析，上清樣品經(jīng)過色譜分離后，肽段先后進入一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜，從而進行分析和鑒定。

1.2.4 細胞免疫熒光

將高壓滅菌的蓋玻片蘸于 0.1%明膠中后放至12孔板中；HA-PPP2R2A和PCDH-hyg-FLAGGFPT1/2重組質(zhì)粒依據(jù)產(chǎn)品說明書進行脂質(zhì)體Lipofectamine@2000瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后消化細胞，將其接種在明膠上生長，24 h后用4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBST (0.2% Triton X-100)洗滌3次，5 min/次，3% BSA封閉1 h；取出玻片加入兔源抗HA一抗和鼠源抗FLAG一抗混合液 (1∶100)，濕盒中4 ℃過夜；PBST (0.2% Triton X-100) 洗滌3次，5 min/次，再加入Dylight 488標記羊抗鼠IgG熒光二抗以及Dylight 594標記羊抗兔 IgG 熒光二抗的混合液 (1∶10)，室溫孵育1 h，需避光；PBST (0.2% Triton X-100) 洗滌3次，5 min/次，DAPI染細胞核，避光靜置5 min；封片并熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 GST Pull-down

PCDH-hyg-FLAG-GFPT1和mGST-HIS-PPP2R2A重組質(zhì)粒依據(jù)產(chǎn)品說明書進行脂質(zhì)體Lipofectamine@2000瞬時轉(zhuǎn)染，24 h后收集細胞抽提蛋白；蛋白上清分成2份，一份取50 μL用作input，剩余的細胞裂解液全部用于GST Pull-down，按每個蛋白樣品需要20 μL GST磁珠，取適量的磁珠用細胞裂解液清洗3次，將GST磁珠加入待測樣品中，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜；次日，小于500×g離心2 min，棄上清，細胞裂解液清洗磁珠 3次，磁珠沉淀加入50 μL 的 SDS 上樣緩沖液，95–100 ℃ 變性 5 min，12 000 r/min離心5 min；Western blotting檢測目的蛋白。

1.2.6 免疫共沉淀 (Co-IP)

PCDH-hyg-FLAG-PPP2R2A和mGST-GFPT1/2重組質(zhì)粒依據(jù)產(chǎn)品說明書進行脂質(zhì)體 Lipofectamine@2000瞬時轉(zhuǎn)染；24 h后收集細胞抽提蛋白，一份取50 μL用作input，剩余的全部用于免疫共沉淀；按每個樣品30 μL×2磁珠，取適量的蛋白A/G，用細胞裂解液清洗3次；蛋白樣品與30 μL蛋白A/G混勻，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育 1 h；小于 500×g離心2 min，棄沉淀，上清加入鼠源FLAG (2 μg) 抗體，4 ℃ 旋轉(zhuǎn)孵育 1 h，再加 30 μL Protein A/G，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日，小于500×g離心2 min，棄上清。用細胞裂解液洗磁珠3次，磁珠沉淀加入50 μL 的SDS 上樣緩沖液中，95–100 ℃變性 5 min，12 000 r/min 離心5 min；Western blotting檢測目的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 串聯(lián)親和法聯(lián)合HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析篩選出PPP2R2A結(jié)合蛋白GFPT1/2

通過慢病毒感染建立SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A穩(wěn)定表達的 MDA-MB-231乳腺癌細胞，Western blotting檢測PPP2R2A表達結(jié)果顯示，除了內(nèi)源性的PPP2R2A條帶外，在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞內(nèi)還有因加入純化標簽而變大的 SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A條帶，與內(nèi)源性PPP2R2A表達水平相當 (圖1)。先通過SBP-HIS8串聯(lián)純化分離PPP2R2A蛋白復合物，進而通過 HPLC-Chip-ESI/MS/MS鑒定與PPP2R2A相互作用的蛋白。蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，除了PPP2R2A蛋白外，還有PP2A復合物蛋白PPP2R1A和PPP2CA，這表明了該方法的可靠性。在被鑒定的蛋白中，GFPT1和GFPT2同屬于 L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶，并且均有多個肽段被鑒定 (表 2)，因此我們將進一步分析PPP2R2A與GFPT1/2間的相互作用。

2.2 PPP2R2A蛋白與GFPT1/2蛋白相互作用的確認

在 HEK293T細胞中，重組質(zhì)粒共瞬時轉(zhuǎn)染PCDH-hyg-FLAG-GFPT1/2和mGST-HIS-PPP2R2A，設置瞬轉(zhuǎn)PCDH-hyg-FLAG空載和mGST-HIS空載作為陰性對照。GST Pull-down結(jié)果顯示PPP2R2A可沉淀細胞中的 FLAG-GFPT1和 FLAG-GFPT-2(圖 2A、B)；反向，使用 FLAG抗體通過 Co-IP分別沉淀FLAG-GFPT1和 FLAG-GFPT2融合蛋白，結(jié)果同樣表明二者均可沉淀細胞中的PPP2R2A蛋白。進一步說明PPP2R2A與GFPT1/2存在相互作用。

圖1 Western blotting檢測SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A穩(wěn)定細胞株的PPP2R2A表達水平Fig. 1 Detection of the expression of PPP2R2A in the stable MDA-MB-231 cells of SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A by using Western blotting.

表2 串聯(lián)親和法聯(lián)合 HPLC-Chip-ESI/MS/MS結(jié)果顯示GFPT1/2是PPP2R2A潛在的結(jié)合蛋白Table 2 The results of tandem affinity and HPLCChip-ESI/MS/MS identified the GFPT1/2 as the potential partner of PPP2R2A

圖2 PPP2R2A蛋白與GFPT1/2蛋白相互作用Fig. 2 The interaction between PPP2R2A and GFPT1/2 was further validated. (A, B) GST Pull-down of PPP2R2A with Flag-GFPT1/2. HEK-293T cells were co-transfected with plasmids expressing GST-tagged PPP2R2A (or empty vector) and Flag-tagged GFPT-1/-2. PPP2R2A was precipitated with GST Pull-down, and the pull-down products were analyzed by anti-Flag immunoblotting. (C) Co-immunoprecipitation (IP) of PPP2R2A with Flag-tagged GFPT1/2.PPP2R2A was immunoprecipitated with an anti-Flag antibody, and co-immunoprecipitated PPP2R2A was analyzed by anti-GST immunoblotting.

2.3 PPP2R2A蛋白與GFPT1/2蛋白在細胞內(nèi)共定位

在HEK 293細胞中，共同轉(zhuǎn)染HA-PPP2R2A和FLAG-GFPT1/2表達質(zhì)粒，用鼠源抗FLAG和兔源抗HA抗體做免疫熒光檢測，結(jié)果如圖3A、B顯示，PPP2R2A與GFPT1/2在細胞中共定位于細胞質(zhì)中。

圖3 PPP2R2A與GFPT1/2在細胞質(zhì)中共定位的免疫熒光結(jié)果Fig. 3 Colocalization of PPP2R2A and GFPT1/2 in cytoplasm. (A, B) GFPT1/2 was co-localized with PPP2R2A in the cytoplasm. The HEK293 cells were co-transfected with plasmids expressing FLAG-GFPT1/2 and HA-PPP2R2A, and after 24 h, cells were fixed and stained with anti-HA (green) and anti-FLAG (red)antibody. And the DAPI were used for nuclear staining.

2.4 PPP2R2A影響GFPT2的磷酸化水平

已有的報道顯示PKA可導致GFPT1/2的磷酸化，為了檢測PPP2R2A去磷酸酶對GFPT1/2磷酸化的影響，我們通過慢病毒感染并表達shRNA，建立PPP2R2A穩(wěn)定下調(diào)的 HEK 293T細胞，Western blotting結(jié)果顯示該shRNA有效下調(diào)PPP2R2A表達。再在該穩(wěn)定細胞株中轉(zhuǎn)染 mGST-GFPT1/2表達質(zhì)粒，用GST-pull down將外源性表達的GST-GFPT1/2進行純化，Anti-GST-WB檢測結(jié)果顯示在PPP2R2A穩(wěn)定下調(diào)細胞和對照細胞中，GST-GFPT1和GST-GFPT2的表達量相同，同時用 PKA底物抗體檢測其磷酸化水平，結(jié)果顯示 PPP2R2A下調(diào)后，GFPT1磷酸化水平改變不明顯，GFPT2磷酸化水平增加 (圖4 A、B)。另外，在FLAG-GFPT2穩(wěn)定表達的MDA-MB-231細胞株中使用shRNA下調(diào)PPP2R2A表達，通過 Anti-FLAG-IP沉淀 FLAGGFPT2蛋白，Anti-PKA substrate WB結(jié)果同樣顯示，PPP2R2A的下調(diào)可促進 GFPT2的磷酸化，與HEK293T中的結(jié)果一致 (圖4 C)。

2.5 在 MDA-MB-231中下調(diào) PPP2R2A促進O-連接的蛋白質(zhì)糖基化修飾

己糖胺途徑是一系列的酶促生化反應，最終生成UDP-GlcNAC，它是蛋白質(zhì)的O-連接的絲氨酸-蘇氨酸的糖基化修飾以及糖原、糖脂修飾的底物，GFPT2是己糖胺途徑中的關鍵限速酶，于是我們又進一步檢測 PPP2R2A下調(diào)對細胞內(nèi)總蛋白S/T-O-GlcNAC糖基化的影響，使用O-GlcNAC抗體 (CTD110.6) 進行Western blotting檢測，結(jié)果 (圖4) 表明下調(diào)PPP2R2A后，乳腺癌細胞中蛋白質(zhì)的 S/T-O-GlcNAC糖基化修飾的水平顯著增加。

圖4 PPP2R2A影響GFPT2的磷酸化水平Fig. 4 Knockdown of PPP2R2A enhanced phosphorylation of GFPT2. (A, B) Knockdown of PPP2R2A by lentivirus-mediated shRNA enhanced the phosphorylation of GFPT2, while the phosphorylation of GFPT1 had no significant change In HEK 293T. The plasmid of GST-GFPT1 or GFPT2 was further transfected into the normal and PPP2R2A-knockdown cells. GST Pull-down was used to precipitated the GFPT1 or GFPT2, and the phosphorylation was detected by the anti-PKA substrate immunoblotting. (C) In MDA-MB-231, knockdown of PPP2R2A enhanced the phosphorylation of GFPT2. MDA-MB-231 cells stably expressing FLAG-GFPT2 were established by infection with lentiviral particles. FLAG-GFPT2 was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody, and phosphorylation of GFPT2 was analyzed by the anti-PKA substrate immunoblotting.

3 討論

PP2A的活性和特異性是通過調(diào)節(jié)亞基調(diào)控的，PPP2R2A作為PP2A復合物的調(diào)節(jié)亞基之一，通過底物特異性結(jié)合從而影響其磷酸化水平[12-13]。已有的研究表明，腫瘤細胞中谷氨酰胺的缺乏會促進PPP2R2A的表達，進而通過抑制P53通路提高腫瘤細胞在此環(huán)境中的生存[9]。為了更加深入地解釋PPP2R2A的分子作用機制，我們進一步尋找新的與PPP2R2A結(jié)合的其他蛋白。

本研究通過慢病毒感染建立 FLAG-SBP-HISPPP2R2A穩(wěn)定表達 MDA-MB-231細胞株，并首次使用 SBP-HIS串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜的方式對PPP2R2A的結(jié)合蛋白進行了分析。與文獻中常使用的其他串聯(lián)標簽純化 (Tandem Tag Purification，TAP) 方法相比，該方式具有以下3個優(yōu)點[14-16]：1) 通過慢病毒感染建立穩(wěn)定表達細胞，PPP2R2A表達量與內(nèi)源性PPP2R2A表達量大致相當，更好地模擬 PPP2R2A內(nèi)源性表達量；2) SBP-tag與Streptavidin-beads具有極高的親和力，再經(jīng)過HIS8-tag純化的方法后，進一步增加了PPP2R2A復合物的純度[17]；3) 第二步HIS-tag的純化不會引入其他過量的外源蛋白 (例如使用抗體時的免疫球蛋白或Streptavidin-beads上的Streptavidin)，從而消除了過量純化基質(zhì)蛋白引入對質(zhì)譜分析的影響。

圖5 PPP2R2A下調(diào)促進S/T-O-GlcNAC糖基化修飾Fig. 5 Cellular O-GlcNAcylation was elevated when PPP2R2A was knocked down in MDA-MB-231 cells.The PPP2R2A were knocked down by using the lentivirus-mediated shRNA, and the cellular O-GlcNAcylation was analyzed by anti-CTD110.6 immunoblotting.

通過該方法，我們鑒定出多個PPP2R2A已知結(jié)合蛋白及許多潛在的相互作用蛋白，其中包括GFPT1和GFPT2。通過GST Pull-down、Co-IP以及免疫熒光，我們進一步確定了PPP2R2A的確能夠與GFPT1/2結(jié)合。人源GFPT1和GFPT2有76%的同源性[18]，自身酶的活性受磷酸化水平的調(diào)控[19]。例如，PKA可通過磷酸化GFPT1的205S (絲氨酸) 而抑制其活性，PKA也可磷酸化GFPT2的202S (絲氨酸) 促進其活性[20-21]。我們的結(jié)果顯示PPP2R2A下調(diào)可增加GFPT2的PKA磷酸化水平。

GFPT1和GFPT2是己糖胺途徑的限速酶，催化谷氨酰胺水解為谷氨酸，使 6-磷酸-果糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸-葡萄糖胺。然后經(jīng)一系列反應產(chǎn)生UDP-GlcNAC，它是蛋白質(zhì)O-連接的絲氨酸-蘇氨酸的糖基化修飾以及糖原、糖脂修飾的底物。參與細胞內(nèi)的多條信號通路的調(diào)控[22-24]。我們的結(jié)果表明PPP2R2A下調(diào)后促進GFPT2磷酸化水平的同時，也會促進細胞內(nèi)總O-GlcNAC糖基化修飾的增加。

在本研究中，我們還通過慢病毒感染在MDA-MB-231細胞中上調(diào)了PPP2R2A的表達，但未檢測到GFPT2和O-GlcNAC糖基化修飾的改變，推測這是由于細胞本身就有很高的內(nèi)源性PPP2R2A蛋白表達。例如，在圖 1中內(nèi)源性PPP2R2A蛋白與慢病毒感染表達的 FLAG-HISPPP2R2A蛋白量很近似；在圖4C中PPP2R2A未下調(diào)的 MDA-MB-231細胞中基本檢測不到GFPT2的磷酸化狀態(tài)，這說明在細胞中具有高活性的PPP2R2A；同時我們也注意到，最近發(fā)表的一篇關于PPP2R2A去磷酸化EDD并調(diào)控P53的報道中[9]，作者同樣僅開展了 PPP2R2A的下調(diào)研究，且在對照組中 EDD磷酸化水平也是幾乎檢測不到。這些均說明在細胞中具有很高的PPP2R2A活性，也提示PPP2R2A具有作為治療靶標的潛力。

另外，在細胞中大約有 80多種蛋白發(fā)生O-GlcNAC糖基化修飾[25]，在接下來的研究中我們將進一步鑒定，哪種關鍵的下游蛋白 O-GlcNAC糖基化修飾的改變介導了 PPP2R2A下調(diào)引起的生物學效應。

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