凌思英，張柏楊，滕勇，魏巍，喻武，孫建明，唐博，陳以寬

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010

干細胞作為組織器官再生修復(fù)的種子細胞，是近年來研究的熱點與難點。從組織器官中獲取的成體干細胞 (Somatic stem cells) 不僅可用于細胞生物學(xué)的體外研究還可參與組織再生[1]。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可促進胃大部切除術(shù)后創(chuàng)面的愈合[2]；小鼠下肢缺血肌肉組織中注射內(nèi)皮祖細胞可促進血管新生[3]；靜脈血栓中注射干細胞可促進血栓溶解[4]。骨髓干細胞動員劑可以促進大鼠深靜脈血栓的機化、溶解和吸收[5]。國內(nèi)外多項研究表明血管外膜存在 CD34、CD117、CD133、CXCR4等陽性干細胞[6]，其參與血管疾病的發(fā)生發(fā)展機制研究受到廣泛重視[7-8]。人大隱靜脈與胚胎組織、骨髓相比相對容易獲取[9]，若能將提取的干細胞用于自體移植，不但可以避免排斥反應(yīng)減少并發(fā)癥，而且這將為疾病的臨床治療提供新的思路和前景。

目前血管壁細胞的提取方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法[3,10-11]，組織塊貼壁法操作簡單，但培養(yǎng)時間較長，而酶消化法在消化完成后可以獲取較多數(shù)量的細胞，但需要嚴格掌握膠原酶濃度及消化時間，技術(shù)要求更高。用這兩種方法得到的血管壁細胞形態(tài)及活性等方面是否有差異仍需進一步研究。因此，本研究旨在相同的條件下，針對大隱靜脈血管壁干細胞提取方法進行研究，以期待高效獲得優(yōu)質(zhì)的原代培養(yǎng)干細胞，為其后續(xù)相關(guān)研究提供支持，為臨床探尋靜脈疾病的治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中的大隱靜脈來源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科，為血管搭橋手術(shù)術(shù)后剩余的正常大隱靜脈，符合倫理學(xué)會要求，患者知情同意。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基 (Lonza公司)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶 (Sigma公司)；臺盼藍染液 (碧云天公司)；堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子 (EGF)、ITS、白細胞抑制因子 (LIF) 購于 R&D公司；兔單克隆 CD34、CD31、VEGF2、SMA抗體，小鼠單克隆 CD117抗體，購于Abcam公司；羊抗兔-FITC 488羊抗鼠-DyLight 549熒光二抗購于Abbkine公司；基質(zhì)膠購于Corning公司。

1.3 原代血管壁細胞的分離培養(yǎng)方法

1.3.1 大隱靜脈的獲取及處理

取血管搭橋手術(shù)后剩余的大隱靜脈，用含有雙抗的PBS沖洗5-6次，去除血管外脂肪組織并洗凈殘留血液。將血管均分為兩段，置于培養(yǎng)皿中并加入培養(yǎng)基充分浸潤血管，用無菌眼科剪分別將兩段血管剪碎成0.2 cm3。

1.3.2 組織貼壁法

將其中一份按照組織塊貼壁法均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2、37 ℃恒溫孵育箱。1.5 h后取出培養(yǎng)瓶，加入2 mL完全培養(yǎng)基(含 10% FBS、鏈霉素+青霉素 100 U/mL、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、0.2% ITS、0.1% LIF)，緩慢放回孵箱，以防組織塊漂浮，7 d后于倒置顯微鏡下觀察并換液。

1.3.3 酶消化法

將另一份組織塊置于50 mL無菌離心管中，加入20 mL 0.1% Ⅱ型膠原酶，于37 ℃水浴鍋中消化6-7 h，其中每半小時搖動5 min，使組織塊與膠原酶充分混合。待組織塊基本消化后，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，并用細胞篩過濾，收集濾液，離心后制成細胞懸液，孵育箱中培養(yǎng)。72 h后于倒置顯微鏡下觀察并換液。

1.4 觀察項目及檢測指標(biāo)

1.4.1 Ⅱ型膠原酶最適消化濃度和時間

分別采用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶各消化 4-5、6-7、8-9 h，計數(shù)每個實驗濃度和時間點獲得的細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析。

1.4.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察兩種方法提取的血管壁細胞生長情況，如細胞形態(tài)、生長狀況、是否貼壁、細胞數(shù)量等。

1.4.3 細胞存活率

用臺盼藍染色液對不同提取方法獲得的P3代細胞進行染色，將細胞懸液與 0.4%臺盼藍溶液按9∶1 (體積比) 混勻，室溫放置3-5 min，于倒置顯微鏡下觀察并計算細胞活率，死細胞著淺藍色并膨大，無光澤，活細胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤。細胞活率 (%) =活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100。

1.4.4 流式細胞術(shù)分選血管壁干細胞

收集細胞懸液，使細胞濃度為1×107個/mL，加入10% BSA，常溫下封閉20 min后重懸細胞，加入CD34-FITC和CD117-APC抗體，于4 ℃避光孵育45 min后加入培養(yǎng)基再次重懸細胞，行流式細胞術(shù)分選血管壁干細胞。采用flow-Jo軟件分析。

1.4.5 細胞免疫熒光染色

在無菌蓋玻片上滴加細胞懸液，待細胞完全貼壁后棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定10 min后用10%山羊血清37 ℃封閉30 min，加入CD34和CD117一抗，4 ℃過夜。次日，于37 ℃避光孵育二抗，1 h后加入DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。于倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像，計數(shù)雙陽性干細胞比例并分析。

1.4.6 細胞陽性率鑒定

收集細胞懸液，使細胞濃度為1×105個/mL，加入 CD31-FITC/VEGF2-FITC/SMA-FITC，于4 ℃避光孵育 30 min后加入培養(yǎng)基再次重懸細胞，行流式細胞術(shù)分選血管壁干細胞，采用flow-Jo軟件分析。

1.4.7 管腔形成實驗

96孔板提前預(yù)冷，冰上操作，每孔加入50 μL基質(zhì)膠，避免產(chǎn)生氣泡，于 37 ℃孵育箱中放置45 min。收集細胞懸液，使細胞濃度為2×105個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，37 ℃孵育箱孵育，分別于3 h和6 h采圖。

1.4.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s) 表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅱ型膠原酶最適消化濃度和時間

分別采用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶各消化 4-5、6-7、8-9 h，將收獲的細胞數(shù)量進行兩因素方差分析，結(jié)果顯示采用 0.10%的Ⅱ型膠原酶消化6-7 h為最適消化濃度和時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖1)。

圖1 Ⅱ型膠原酶消化濃度和時間分析Fig. 1 Number of vascular cells obtained at different concentrations of collagenase Ⅱ and different digestion times. The results showed that the yield was highest when digested with 0.10% collagenase Ⅱ for 6-7 hours.**P<0.01.

2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察，組織塊貼壁法7 d后有少量細胞爬出，形態(tài)多呈梭形、三角形，未形成集落樣生長。14 d時，細胞數(shù)量增多，出現(xiàn)纖維樣細胞，胞體小，呈細絲狀。P1代細胞有部分聚集現(xiàn)象，但數(shù)量少，細胞體積較小，形態(tài)良好。當(dāng)傳至 P3代時出現(xiàn)纖維化老化等現(xiàn)象(圖 2 A–D)。采用酶消化法獲得的血管壁細胞48 h后貼壁，伸出偽足，細胞形態(tài)多為梭形、三角形、不規(guī)則形，呈集落樣分布。7 d后細胞完全展開，集落增大變多，細胞排列緊密，形態(tài)佳。P1代細胞集落被吹散，但仍可見到細胞聚集現(xiàn)象，單個細胞形態(tài)良好。P3代時細胞仍可見聚集生長現(xiàn)象，纖維化細胞明顯少于組織塊法(圖 2 E–H)。

2.3 細胞存活率

臺盼藍染色結(jié)果顯示，組織塊法細胞存活率為 (91.7±1.2)%，酶消化法為 (97.2±0.65)%，對兩個結(jié)果進行獨立樣本t檢驗，P=0.005，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖3)。

圖2 倒置顯微鏡下血管壁細胞形態(tài)Fig. 2 Morphology of GSV cells under inverted microscope. Panels A–D show cells obtained by tissue attachment method at day 7, at day 14, at passage 1 (P1)and at passage 3 (P3). Panels E–H show cells isolated by enzymatic digestion at 48 h, at day 7, at P1 and at P3.Scale bars=100 μm.

圖3 組織塊法和酶消化法對細胞存活率的比較Fig. 3 Comparison of survival rates of cells derived from tissue attachment and enzymatic digestion.**P<0.01.

2.4 流式分選大隱靜脈干細胞

流式分選結(jié)果表明兩種血管壁細胞提取法均可獲得CD34、CD117雙陽性干細胞，其中組織塊獲得干細胞的陽性率為 (0.16±0.05)%，酶消化法為 (0.44±0.07)% (圖 4A，B)。對兩組分選結(jié)果進行獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005，圖4C)，說明采用酶消化法可獲得更多CD34+CD117+雙陽性干細胞，且實驗周期短。

圖4 組織塊法 (A) 和酶消化法 (B) 得到的P3代細胞進行流式分選 (將分選結(jié)果進行獨立樣本t檢驗)Fig. 4 Flow sorting of P3 cell derived from tissue attachment (A) and enzymatic digestion (B), respectively. Storing results of the two groups were assessed with independent t-test, **P<0.01 (C).

2.5 細胞免疫熒光染色

流式分選后獲得雙陽性干細胞，培養(yǎng)1周后進行CD34 (綠光)、CD117 (紅光) 免疫熒光染色(圖5A)，隨機選取5個視野計算陽性率，其中組織塊獲得干細胞的陽性率為 (89.41±2.06)%，酶消化法為 (94.03±1.83)%，結(jié)果進行獨立樣本t檢驗，P=0.04，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖5B)。

2.6 細胞陽性率鑒定

流式細胞儀檢測分選出的干細胞中 CD31、VEGF2、SMA 含量分別為 (0.12±0.01)%、(0.19±0.02)%、(0.45±0.01)%，結(jié)果進行獨立樣本t檢驗，P>0.05。與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)，排除成熟內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞存在的可能性。

2.7 成管實驗

37 ℃孵育箱孵育3 h后有部分干細胞匯合，但未形成完整管腔，(圖 7A)，6 h后管腔完全形成，(圖7B)，說明大隱靜脈分選出的干細胞具有向內(nèi)皮細胞分化形成管腔的潛能。

圖5 流式分選7 d后CD34、CD117染色 (A) 并將兩組陽性率進行比較 (B)Fig. 5 Double positive cells cultured for 7 days after flow sorting were subjected to immunofluorescent staining for CD34 (FITC 488; green) and CD117 (DyLight 549; red). (A) Scale bars=100 μm. (B) Graph was shown as ±s compared with control, *P<0.05.

3 討論

人類及動物的血管壁中主要存在4種具有分化和增殖能力的干細胞，即間充質(zhì)干細胞、周細胞、內(nèi)皮祖細胞、平滑肌祖細胞[12-13]。迄今為止對于這些血管壁祖細胞尚未明確定論，單純用Sca-1、CD34高表達不足以描述，因為這些祖細胞間細胞表面標(biāo)記物存在重疊范圍，這反過來又使得定義特定的子集很難[14]?？蒲袌F隊在該領(lǐng)域經(jīng)過不斷探索發(fā)現(xiàn)了許多具有意義的研究結(jié)果。但總的來說，對于血管壁干細胞的研究目前還處于早期階段。Havelka等[15]和 Majesky等[16]認為內(nèi)皮祖細胞最初來源于骨髓和外周血，然而真正的血管壁干細胞是來源于血管壁之中。成體干細胞主要參與組織的再生修復(fù)，而骨髓間充質(zhì)干細胞來源于發(fā)育早期的中胚層，具有多項分化潛能、造血支持以及促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點[17]。干細胞的獲取及多向分化潛能是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點，如何獲得一種來源穩(wěn)定的多能干細胞成為再生醫(yī)學(xué)的主要研究方向[18]。研究表明，成體干細胞 (SSC) 與骨髓間充質(zhì)干細胞在免疫表型、生長動力學(xué)、特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控、端粒酶活性等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義[19]。Campagnolo 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人大隱靜脈血管外膜中存在一種可高度增殖并表達間充質(zhì)干細胞標(biāo)記物Sox2的CD34+CD31-成體干細胞，其具有克隆和多項分化潛能，在體外可誘導(dǎo)分化為多種細胞，如成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、肌細胞和神經(jīng)元細胞。干細胞的多項分化潛能使其在再生醫(yī)學(xué)、體外疾病模擬、藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。干細胞技術(shù)近年來取得了很大進展，特別是多能干細胞的出現(xiàn)，使干細胞領(lǐng)域發(fā)生了巨大的變化[20]。

圖6 流式分選的干細胞進行CD31、VEGF2、SMA陽性率鑒定 (A)，并與陰性對照進行統(tǒng)計分析 (B)Fig. 6 Identification of positive rates of CD31, VEGF2 and SMA by Stem cells sorting by flow cytometry (A). (B)Graph shown as ±s compared with control, P>0.05.

圖7 細胞接種后分別于3 h (A)、6 h (B) 觀察管腔形成情況Fig. 7 Tube formation was observed under inverse microscope after seeded into 96-well plates for 3 hours (A) and 6 hours (B). Scale bars=100 μm.

本研究選用人大隱靜脈作為血管壁干細胞來源，將血管搭橋手術(shù)后剩余的正常大隱靜脈用于實驗研究，可獲得豐富的血管壁干細胞，并且自體移植干細胞治療缺血性疾病與異體移植相比更加安全、有效。另一方面靶向阻斷病理性血管干細胞可抑制血管生成與腫瘤生長[21]。組織塊貼壁法獲取血管壁干細胞雖然可行，但在研究應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)一些不足，如干細胞收獲率不理想，培養(yǎng)時間過長，直接影響細胞的生長狀態(tài)，不但延緩了實驗進度，而且浪費了科研經(jīng)費。近年來，酶消化法獲取血管壁干細胞的方法增多，但消化酶的作用時間和消化強度尚無明確定論[3,6,11]，故本研究通過對膠原酶濃度和消化時間進行反復(fù)摸索，分別用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶消化4-5、6-7、8-9 h，發(fā)現(xiàn)消化酶濃度過高或消化時間過長會導(dǎo)致大量細胞破裂，喪失貼壁能力，而消化酶濃度過低或消化時間過短又影響細胞獲取率。通過不斷的技術(shù)改進，最終確定0.1%的Ⅱ型膠原酶消化6-7 h可最大數(shù)量獲取血管壁細胞，細胞活性好。與組織塊法相比，酶消化法提取的血管壁細胞48 h后已有部分細胞貼壁，實驗周期短，獲得的細胞數(shù)量多呈明顯的集落樣生長。但在細胞存活率方面經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)酶消化法優(yōu)勢并不十分明顯，可能因統(tǒng)計次數(shù)較少和組內(nèi)差異較小等原因引起，在后續(xù)試驗中應(yīng)增加實驗次數(shù)以及加入其他方面的比較，如流式細胞儀測量法、CCK-8法、MTT法、LDH釋放法等[22]。

綜上所述，對于人大隱靜脈干細胞培養(yǎng)采用酶消化法效果相對較好。分選出的干細胞進行管腔形成實驗證實其具有向內(nèi)皮分化的潛能[23]。本研究團隊進一步證實，將人大隱靜脈分選出的CD34、CD117雙陽性干細胞移植到裸鼠結(jié)扎的下腔靜脈外膜，在某些細胞因子的誘導(dǎo)下這些干細胞可以遷徙進入血栓，促進血栓的溶解[24]。血管的形成是生命發(fā)展的基礎(chǔ)，失調(diào)可能導(dǎo)致疾病甚至死亡，這將成為一個潛在的治療靶點。干細胞的獲取和擴大培養(yǎng)還可用于組織再生，甚至與組織來源無關(guān)的胚層起源研究，但存在一些關(guān)鍵問題，如這些細胞在體外具有多向分化潛能，而目前尚未證實其在體內(nèi)是否具有相似性。細胞系絕大部分還未能滿足臨床要求而限制了其臨床應(yīng)用[25]?？傊?，血管壁祖細胞在血管愈合和血管生成中發(fā)揮重要作用。精確不同祖細胞群的定義和特征及其在生理和病理條件下功能效應(yīng)研究將會推動具有臨床潛力的細胞療法的發(fā)展，用于治療動脈粥樣硬化和其他心血管疾病。

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