王思樂，王寧，蔡元星，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (hiPS細(xì)胞) 具有多向分化和自我更新的潛能，它是將外源多能轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc導(dǎo)入成體細(xì)胞，經(jīng)過體細(xì)胞重編程獲得的[1-2]。iPS細(xì)胞具有分化為內(nèi)、中、外三個胚層細(xì)胞和各種組織、器官的能力，可以用于構(gòu)建臨床疾病的體外細(xì)胞模型，研究相關(guān)病理損傷細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制和治療方法[3-5]?；趆iPS細(xì)胞的擴(kuò)繁增殖潛能和體外分化能力，可以利用hiPS經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞，然后再進(jìn)一步向紅細(xì)胞系方向特異誘導(dǎo)分化，最終獲得成熟紅細(xì)胞，為血液病的臨床治療提供了基本原理和技術(shù)手段。另外，人間充質(zhì)干細(xì)胞 (hMSC細(xì)胞) 除了具有體外增殖和多向分化能力外，還具有免疫原性低的特點[6-7]，因此，常被用于再生醫(yī)學(xué)的研究，例如將hMSC作為實驗材料，使其特異分化為軟骨等組織中的細(xì)胞，來修復(fù)機(jī)體損傷的部分[8-10]。

紅細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育起始于胚胎時期的卵黃囊血島組織，最初產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞。隨后在主動脈-性腺-中腎區(qū) (AGM) 產(chǎn)生造血祖細(xì)胞，隨著胎兒肝臟的形成，卵黃囊和 AGM 區(qū)的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胎兒肝臟，造血祖細(xì)胞 (HSC細(xì)胞) 在此產(chǎn)生和發(fā)育。胎兒出生后，只在骨髓產(chǎn)生的造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞繼續(xù)分化為成熟的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等多種細(xì)胞系[11]。體外誘導(dǎo)紅細(xì)胞也是利用hiPS模擬體內(nèi)發(fā)育階段將其先誘導(dǎo)為造血祖細(xì)胞，再使其分化為紅細(xì)胞[12-14]；或直接利用HSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞[15-16]。目前，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生紅細(xì)胞的方法主要有類胚體 (EB) 法和共培養(yǎng)法兩種方式。采用類胚體誘導(dǎo)分化的技術(shù)方法，是利用人胚胎干細(xì)胞 (hES細(xì)胞) 或 hiPS，通過懸浮培養(yǎng)形成EB，然后EB再在特異誘導(dǎo)因子或與基質(zhì)細(xì)胞 (如鼠源BM 細(xì)胞S17和OP9，內(nèi)皮細(xì)胞 C166等) 共培養(yǎng)的條件下[17-19]，使其分化為成熟紅細(xì)胞。但是，這種 EB法的誘導(dǎo)體系通常涉及3–4個誘導(dǎo)階段，操作步驟過于繁瑣，且所需成本較高。而產(chǎn)生的紅細(xì)胞不能確保完全脫核，帶核的紅細(xì)胞可能存在基因突變等危險，并且誘導(dǎo)體系中含有胎牛血清、基質(zhì)細(xì)胞等動物源性物質(zhì)的干擾，所以還不能用于臨床輸血[17-26]。共培養(yǎng)方法首先利用hES或hiPS與基質(zhì)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，形成造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞 (即hemangioblasts)，然后將誘導(dǎo)獲得的hemangioblasts向紅細(xì)胞方向誘導(dǎo)，最后將獲得的紅細(xì)胞收集，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)從而提升紅細(xì)胞的脫核率[17,26]。由于這些體外紅細(xì)胞的誘導(dǎo)技術(shù)在不同程度上使用了胎牛血清FBS和飼養(yǎng)層共培養(yǎng)細(xì)胞等動物源性物質(zhì)，因此，臨床應(yīng)用價值有限。另外，最終獲得的紅細(xì)胞只有極少部分能夠成為完全成熟的紅細(xì)胞，產(chǎn)量低。與上述方法不同，本研究采用兩步誘導(dǎo)法，先利用多能干細(xì)胞誘導(dǎo)得到 CD31和CD34陽性表達(dá)的細(xì)胞群，再將獲得的CD31+和 CD34+的細(xì)胞群通過半懸浮培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞。

本研究中特別選用了 hUCMSCRh-A細(xì)胞進(jìn)行兩步法誘導(dǎo)，其目的在于最終誘導(dǎo)獲得的紅細(xì)胞將不攜帶Rh抗原，為體外大量制造Rh陰性的“萬能血”提供技術(shù)探索。本研究采用獨(dú)特的紅細(xì)胞兩步誘導(dǎo)法，與之前報道的方法相比，操作更為簡便，成本較低，不涉及胎牛血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞等動物源物質(zhì)的干擾，可以大量制備成熟紅細(xì)胞，且產(chǎn)出效率較以往的體系有明顯提升。這一新的技術(shù)方法有助于推進(jìn)人紅細(xì)胞的體外誘導(dǎo)研究和體外大量制備及其臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

人iPS細(xì)胞 (hiPSCs) 購自斯丹賽有限公司，Rh陰性A型人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (hUCMSCRh-A)由西安市九州醫(yī)藥科技園有限公司提供，人全血細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)校醫(yī)院提供。

1.2 試劑和耗材

總 RNA提取試劑盒購自天根生化科技公司；DNA marker來自BioLabs公司 (美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞消化液 (Cell Dissociation Buffer, CDB，13151014)、AlbuMAX?Ⅰ富脂牛血清白蛋白 (BSA，1116392)、胰酶 (Trypsin，1809364)、非必需氨基酸(Nonessential amino acid，NEAA，1703183) 和 L-谷氨酸 (GlutaMAX，L-Gln，1848033) 均購自 Gibco公司 (美國)；DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium，AB10101516)、α-MEM (Alpha Minimum essential medium，AB212879)、胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，1P1506) 購自Hyclone公司；人 bFGF (Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF，100-18B)、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4，120-05)、VEGF (Vascular endothelial growth factor，100-20)、Flt3 ligand (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand，300-19)、EPO (Erythropoietin，100-64) 購自PeproTech公司；SCF (Recombinant human stem cell factor，255-SC-010/CF) 購自R&D system公司；Y27632 (ROCK 抑制劑，562822)、Matrigel膠(354234)、CD31 (5090933)、CD34 (28476)、CD44(37383)、CD45 (28444)、CD71 (05021207) 流式抗體均購自BD公司 (美國)；mTeSRTM1培養(yǎng)基 (85850)和造血干細(xì)胞培養(yǎng)基 (09600) 購自 Stemcell公司(加拿大)；Stemline Ⅱ 造血培養(yǎng)基 (S0192)、β-巰基乙醇 (2-Mercaptoethanol，β-ME，SHBD0359V)、甲基纖維素 (Methyl cellulose，MC，V900506) 購自Sigma (美國)；IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，1732829) 等購自Invitrogen (美國)；PCR Mix購自西安 Tsingke公司；PCR引物由西安Tsingke公司合成 (表1)。

表1 引物信息表Table 1 Primers used in this study

誘導(dǎo)實驗中涉及如下培養(yǎng)液：BVF培養(yǎng)液(Stemline Ⅱ造血培養(yǎng)基，50 ng/mL BMP4，50 ng/mL VEGF，50 ng/mL bFGF)、BGM培養(yǎng)液 (造血干細(xì)胞培養(yǎng)基，50 μg/mL VEGF，25 μg/mL Flt3 ligand，8 μg/mL bFGF)、BGME 培養(yǎng)液 (BGM 培養(yǎng)液，3 units/mL EPO)、SSE培養(yǎng)液 (Stemline Ⅱ 造血培養(yǎng)基，50 ng/mL SCF，3 unit/mL EPO)、SSEMC培養(yǎng)液 (SSE培養(yǎng)液，0.5% MC)、SSE34培養(yǎng)液(StemPro-34 SCF培養(yǎng)基，50 ng/mL SCF，3 unit/mL EPO)、SE34培養(yǎng)液 (StemPro-34 SCF培養(yǎng)基，3 unit/mL EPO)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的 hUCMSCRh-A細(xì)胞培養(yǎng)在 α-MEM中，并添加15% FBS、1% NEAA、1% GlutaMAX和0.1 mmol/L β-ME。待細(xì)胞密度長至80%左右，用0.05%胰酶消化傳代，將擴(kuò)增的細(xì)胞采用細(xì)胞凍存技術(shù)冷凍保存。hiPSC細(xì)胞采用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)皿用Matrigel膠預(yù)先處理好，培養(yǎng) 6–7 d用細(xì)胞消化液消化傳代。hUCMSCRh-A和hiPSC細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫箱中。

1.4 總RNA提取、PCR和熒光定量RT-PCR

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，將細(xì)胞消化離心，并向收集的沉淀中加入 RZ細(xì)胞裂解液。隨后按照總RNA提取試劑盒提取RNA，并檢測OD值。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。用 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90等特異引物 (表 1)，按照 PCR Mix說明書進(jìn)行PCR，程序為：96 ℃ 2 min；96 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小。熒光定量RT-PCR根據(jù)設(shè)計的 qβ-globin、qγ-globin、qε-globin引物，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增程序，并用2–ΔΔCt法計算表達(dá)變化倍數(shù)。

1.5 hUCMSCRh-A和hiPSC細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為 BRC細(xì)胞主要經(jīng)過兩個階段的誘導(dǎo)分化過程 (圖1)。第一階段的誘導(dǎo)實驗采用 BVF培養(yǎng)液，將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為 CD31+和 CD34+的陽性細(xì)胞群。采用hUCMSCRh-A細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)時，選取培養(yǎng)至第5代的細(xì)胞并調(diào)整其密度為 8×104–10×104個/mL，將其接入直徑35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿。然后第2天換BVF培養(yǎng)液，記為誘導(dǎo)第0天。誘導(dǎo)期間2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞長到80%左右，用Accutase消化傳代。此階段持續(xù)誘導(dǎo)至第10天。采用hiPSC細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)時，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104–4×104個/mL。接入預(yù)先鋪好四型膠原直徑為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并添加終濃度為10 μmol/L的Y27632。第2天換BVF培養(yǎng)液，記為誘導(dǎo)第0天。2 d換液1次，并持續(xù)誘導(dǎo)至第6天。通過上述方法，誘導(dǎo) hUCMSCRh-A和 hiPSC細(xì)胞分化，可獲得CD31+和CD34+的細(xì)胞群。

圖1 誘導(dǎo)分化流程圖Fig. 1 Scheme of two stages of cell differentiation.

1.6 誘導(dǎo)紅細(xì)胞

第二階段的誘導(dǎo)過程為將含有 CD31+和CD34+陽性細(xì)胞的細(xì)胞群通過半懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞。首先，將第一步誘導(dǎo)獲得的CD31+和CD34+的細(xì)胞群用Accutase消化后收集，細(xì)胞計數(shù)后用 Stemline Ⅱ培養(yǎng)基重懸，每1×105–1.5×105個細(xì)胞 (<0.1 mL) 與 2.5–3 mL BGM培養(yǎng)液混勻。使用16號針頭的注射器將細(xì)胞混合物加入到低吸附的6孔板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫箱中，記為第二階段誘導(dǎo)的第0天。誘導(dǎo)至第6天，添加2 mL BGME培養(yǎng)液。并持續(xù)誘導(dǎo)至第9天，添加與培養(yǎng)皿中液體等體積的BGME培養(yǎng)液。當(dāng)誘導(dǎo)至第14天，將培養(yǎng)皿內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至直徑100 mm的低吸附培養(yǎng)皿中，加入與現(xiàn)有培養(yǎng)基液體積等量的SSE培養(yǎng)液。隨后誘導(dǎo)至第17天，加入現(xiàn)有體積一半的SSEMC培養(yǎng)液，每2–3 d加液1次，再繼續(xù)孵育7 d。接下來，使用含0.5% BSA的IMDM培養(yǎng)液，在誘導(dǎo)第24天用IMDM培養(yǎng)液稀釋培養(yǎng)皿中的液體。用5倍于培養(yǎng)皿液體的IMDM培養(yǎng)液，在2 000 r/min、15 min的條件下離心并收集細(xì)胞。隨后用IMDM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接入組織培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)。然后在誘導(dǎo)的第25天離心并收集組織培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，使用SSE34培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，2 d換液 1次并持續(xù)誘導(dǎo)至第 31天。最后換為SE34培養(yǎng)液，持續(xù)誘導(dǎo)至第36天，可獲得成熟紅細(xì)胞。將獲得的成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞離心管，自然沉降后有肉眼可見的細(xì)胞紅色沉淀。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測

當(dāng)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞長至 90%-100%，使用Accutase消化細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。用 FACS緩沖液 (3% FBS，97% PBS) 重懸細(xì)胞沉淀，并清洗 2次。隨后調(diào)整細(xì)胞密度為 2×105–3×105個/管，并向每管加入20 μL抗體和80 μL FACS緩沖液，遮光置于冰上染色 30 min。之后每管加入 1 mL FACS緩沖液，離心洗去抗體。最后用500 μL FACS緩沖液重懸，準(zhǔn)備上機(jī)檢測。

1.8 吉姆薩染色

用移液管吸取10–20 μL待檢溶液滴在載玻片上，均勻涂布。室溫下陰干后，用固定液固定涂片10 min。隨后將涂片置姬姆薩工作液中，染色30 min。染色完成后，涂片立即用蒸餾水洗脫。最后用甘油壓片，指甲油封固，置于顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

吉姆薩染色后的誘導(dǎo)紅細(xì)胞和人紅細(xì)胞，分別統(tǒng)計其紅細(xì)胞和脫核紅細(xì)胞的總數(shù)，并經(jīng)過t-test檢驗差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人UCMSCRh-A細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

hUCMSCRh-A細(xì)胞體外培養(yǎng)，細(xì)胞傳代至第10代后，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變，呈現(xiàn)較短的梭狀形態(tài)，大小為十幾微米，體外培養(yǎng)期間并沒有出現(xiàn)細(xì)胞衰老和分化的現(xiàn)象(圖2A)。待hUCMSCRh-A長滿時收樣做PCR檢測。利用 RCR檢測 hUCMSCRh-A相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，hUCMSCRh-A細(xì)胞表達(dá)CD29、CD90和CD117基因，不表達(dá)造血相關(guān)的基因，如基因CD31、CD34和CD45(圖2B)。隨后，采用細(xì)胞流式儀檢測hUCMSCRh-A蛋白水平的表達(dá)。收取hUCMSCRh-A細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞流式儀的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD44陽性的hUCMSCRh-A細(xì)胞占98%，CD71陽性的 hUCMSCRh-A細(xì)胞占 81.4%；而 CD31、CD34和 CD45陽性的 hUCMSCRh-A細(xì)胞最高只有0.2% (圖2C)。上述結(jié)果表明hUCMSCRh-A細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記CD29、CD44、CD90等，不表達(dá)CD31、CD34等造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記。

圖2 hUCMSCRh-A細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定Fig. 2 Culture and evaluation of hUCMSCRh-A. (A) Morphology of hUCMSCRh-A. (B) PCR analysis of cell surface markers in hUCMSCRh-A. (C) Flow cytometry analysis of cell surface markers in hUCMSCRh-A.

2.2 多能干細(xì)胞向 CD31+和 CD34+的細(xì)胞群分化

采用體外培養(yǎng)至第5代的hUCMSCRh-A細(xì)胞，進(jìn)行第一階段的誘導(dǎo)分化實驗。細(xì)胞在分化過程中，第2天誘導(dǎo)的形態(tài)無明顯差異；第4天時，細(xì)胞已基本長滿，需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。到第6天時，可發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞變?yōu)樯扉L的梭形；繼續(xù)誘導(dǎo)至第8天時，細(xì)胞長滿。傳代后長至第10天，可以清楚地觀察到細(xì)胞的大小較第0天有明顯的改變，細(xì)胞全部變?yōu)檩^長的梭形 (圖 3A)。在誘導(dǎo)過程中，每2 d取樣1次，持續(xù)至第18天。通過RT-PCR檢測，可以看出 hUCMSCRh-A細(xì)胞分化后，細(xì)胞在第8天開始有CD31和CD34基因的表達(dá)，且表達(dá)量在第10天達(dá)到最大值，而之后這些基因的表達(dá)水平逐漸降低。并且，hUCMSCRh-A細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CD29、CD90、CD117，不表達(dá)CD45(圖3B)。因此，我們采用誘導(dǎo)至第10天和第14天的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測 CD31和CD34的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)第10天時，帶CD31標(biāo)記的細(xì)胞比率為 5.3%，CD34標(biāo)記的細(xì)胞比率為22.7% (圖 3C)。而第 14天時，帶 CD31標(biāo)記的細(xì)胞比率下降至 1.22%，CD34標(biāo)記的細(xì)胞比率降至5.57% (圖3D)。上述結(jié)果顯示，經(jīng)過第一階段的誘導(dǎo)，hUCMSCRh-A細(xì)胞能夠分化成為CD31+和CD34+的細(xì)胞群，并表達(dá)造血干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記。

人iPS細(xì)胞進(jìn)行第一階段的誘導(dǎo)分化實驗，在誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞的形態(tài)變化非常明顯。從誘導(dǎo)的第0–2天，細(xì)胞克隆逐漸長大，且克隆數(shù)目明顯增多。至第 4天時細(xì)胞克隆已長成片狀，細(xì)胞邊緣開始分化為多邊形的上皮樣。第6天時克隆已扁平，細(xì)胞大部分都成為上皮樣形態(tài)，且更為致密 (圖 4A)。將誘導(dǎo)至第 6天的細(xì)胞收樣，制備單細(xì)胞懸液并用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，帶有CD31標(biāo)記的細(xì)胞比率為31.2%，帶有CD34標(biāo)記的細(xì)胞比率為 8.2% (圖 4B)。通過體外貼壁誘導(dǎo)階段，人iPS細(xì)胞可分化為CD31+和CD34+的細(xì)胞群。

2.3 CD31+和 CD34+的細(xì)胞群向紅細(xì)胞誘導(dǎo)分化

將第一階段貼壁誘導(dǎo)獲得的CD31+和CD34+的陽性細(xì)胞群消化離心，再經(jīng)過36 d的半懸浮誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化為成熟紅細(xì)胞。首先，將獲得的成熟紅細(xì)胞取樣，利用吉姆薩染色的方法，通過顯微鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，且有完全粉紅色無細(xì)胞核的紅細(xì)胞。而誘導(dǎo)分化所獲得的紅細(xì)胞，通過計數(shù)統(tǒng)計，直徑在7–8 μm之間的脫核紅細(xì)胞比例可達(dá)87.09% (P<0.05)，說明其形態(tài)與正常人紅細(xì)胞相比差異較小，大小也與正常人紅細(xì)胞相近 (圖 5A)。為了檢測紅細(xì)胞中成熟β-globin的表達(dá)水平，我們采用熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的紅細(xì)胞中3種球蛋白 (成熟期的β-globin、胎兒期的γ-globin和胚胎期的ε-globin) 的表達(dá)比例分別是20%、74%和6%(圖5B)，其中β-globin的表達(dá)量占整體globin的20%，說明誘導(dǎo)的成熟紅細(xì)胞具備攜氧能力。最后，將誘導(dǎo)的紅細(xì)胞收集到細(xì)胞離心管中，自然靜置沉降2 h后，肉眼可看見紅細(xì)胞沉淀，且與人全血靜置后的沉淀顏色相似。細(xì)胞計數(shù)得到4.2×107hiPSC/mL，與起始時 3×104–4×104hiPSC/mL的細(xì)胞數(shù)相比，誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅細(xì)胞數(shù)量是起始iPS細(xì)胞量的1 050–1 400倍，同時也是第一階段CD31+和 CD34+細(xì)胞群 (1×105–1.5×105個) 的 280–420 倍(圖 5C，5D)。

圖3 hUCMSCRh-A細(xì)胞誘導(dǎo)分化為CD31+和CD34+的細(xì)胞群Fig. 3 Differentiation of hUCMSCRh-A into CD31+ and CD34+ cells. (A) Morphology of induced hUCMSCRh-A cells in different time points. (B) RT-PCR analysis of cell surface markers from induced hUCMSCRh-A cells. (C, D) Flow cytometry analysis of CD31+ and CD34+ cells derived from hUCMSCRh-A cells.

圖4 hiPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為CD31+和CD34+的細(xì)胞群Fig. 4 Differentiation of hiPS into CD31+ and CD34+ cells. (A) Morphology of induced hiPS in different time points.(B) Flow cytometry analysis of CD31+ and CD34+ cells.

圖5 CD31+和CD34+的細(xì)胞群分化為紅細(xì)胞Fig. 5 Differentiation of CD31+ and CD34+ cells into RBC. (A) Giemsa staining of induced RBC. NC: negative control. (B) qRT-PCR analysis of globin expression in induced RBCs. (C) Static settlement of induced RBCs. (D) Static settlement of human whole blood.

3 討論

目前，急性白血病、慢性白血病、骨髓增生異常綜合癥等各種血液疾病的治療方法主要依賴于臨床輸血，而當(dāng)務(wù)之急是體外大量制備成熟的紅細(xì)胞[20-21]。人iPS因其強(qiáng)大的分化和增殖能力，我們選取其作為研究模型，可按照我們優(yōu)化的誘導(dǎo)體系將其向紅細(xì)胞分化。而這種方法的實現(xiàn)，提供了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化的一種手段，我們采用 Rh陰性的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，其誘導(dǎo)出的細(xì)胞是不含 Rh抗體的，為實現(xiàn) Rh陰性的 O型“萬能血”提供了可能。以往體外紅細(xì)胞誘導(dǎo)通過 EB或共培養(yǎng)的體系，但是這兩種方法的操作復(fù)雜，誘導(dǎo)效率低，且由于體系中含有動物源性物質(zhì)，所以制備的紅細(xì)胞無法用于臨床的輸血應(yīng)急。本文的兩步法誘導(dǎo)紅細(xì)胞(圖 1)，將人 iPS細(xì)胞和人 UCMSCRh-A細(xì)胞，在無動物源性物質(zhì)干擾的條件下，省去了第一階段的 EB懸浮和與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)步驟，經(jīng)過貼壁誘導(dǎo)，使其分化為CD31+和CD34+的細(xì)胞群；然后利用收集的CD31+和CD34+的細(xì)胞群，經(jīng)第二步半懸浮體系的誘導(dǎo)，在不與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下使其最終分化為成熟的紅細(xì)胞。這種方法相比以往的紅細(xì)胞誘導(dǎo)體系，省去了多階段培養(yǎng)的繁瑣步驟，還降低了實驗成本。其中采用的無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞等無動物源性物質(zhì)的培養(yǎng)體系，排除了其他物質(zhì)的干擾，產(chǎn)生的成熟紅細(xì)胞可用于臨床輸血研究。在第一階段的誘導(dǎo)過程中，與人iPS細(xì)胞相比，人UCMSCRh-A細(xì)胞的誘導(dǎo)時間更長。人iPS細(xì)胞的第一階段誘導(dǎo)需要6 d的持續(xù)誘導(dǎo)，而人UCMSCRh-A細(xì)胞則需要至少10 d的持續(xù)誘導(dǎo)，才能獲得較理想的CD31+和CD34+的細(xì)胞群。除此之外，由人iPS細(xì)胞分化的細(xì)胞，更傾向于表達(dá)CD31；相反，人UCMSCRh-A分化的細(xì)胞更傾向于表達(dá) CD34。并且，兩種細(xì)胞在BVF培養(yǎng)液中的增殖速度都較分化前更快。然而，CD31+和 CD34+的細(xì)胞群的誘導(dǎo)效率還有待提高，可通過磁珠分選的方法富集CD31+和CD34+的細(xì)胞群，從而為后續(xù)誘導(dǎo)提供更多的種子細(xì)胞。在第二階段血紅蛋白的檢測中，由于血紅蛋白是由4條球蛋白鏈組成的四級結(jié)構(gòu)，每一條鏈中均有一個疏水結(jié)構(gòu)，可結(jié)合一個血紅素并攜帶一分子氧。在胚胎期血紅蛋白主要由兩條α鏈和兩條γ鏈組成 (α2γ2)，在胎兒期主要由 α2ε2組成，在成熟期主要由α2β2組成[14,27]。我們分別檢測了胚胎期的ε-globin、胎兒期的γ-globin和成熟期的β-globin來驗證誘導(dǎo)的紅細(xì)胞是否進(jìn)入了成熟階段。人iPS細(xì)胞來源廣泛，增殖能力強(qiáng)，是體外誘導(dǎo)成熟紅細(xì)胞重要的細(xì)胞來源；而人UCMSCRh-A細(xì)胞，由于其不攜帶 Rh抗原，所以誘導(dǎo)獲得的成熟紅細(xì)胞也是 Rh陰性。若將本實驗的誘導(dǎo)體系應(yīng)用到人UCMSCRh-O細(xì)胞，則可大量誘導(dǎo)出不含 Rh-O抗體的紅細(xì)胞，實現(xiàn)體外制備“萬能血”的技術(shù)方法，這對于臨床輸血的研究有著重大的意義。

本研究在無動物源性物質(zhì)干擾的前提下，以獨(dú)特的兩步法，成功將人 iPS細(xì)胞和人UCMSCRh-A細(xì)胞特異誘導(dǎo)為成熟紅細(xì)胞。本方法的誘導(dǎo)效率相比 EB法和共培養(yǎng)法的效率有所提高[12,16-22,24-26]，由人iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的紅細(xì)胞中成熟紅細(xì)胞標(biāo)志性的β-globin表達(dá)由之前的16%提升至 20%[16,26]，但由人 MSC細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的紅細(xì)胞效率并不高，說明本方法的第二階段并不適用于人MSC細(xì)胞。通過吉姆薩染色法可以觀察到，誘導(dǎo)的成熟紅細(xì)胞形態(tài)及大小與正常人紅細(xì)胞相似，并有紅細(xì)胞去核的現(xiàn)象。但誘導(dǎo)的成熟紅細(xì)胞，相比人全血的紅細(xì)胞數(shù)量較少，并且誘導(dǎo)紅細(xì)胞的脫核效率可通過與人間充質(zhì)細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)來提高[17,25-26]。綜上所述，我們的研究成果為優(yōu)化人體外誘導(dǎo)紅細(xì)胞提供了技術(shù)改進(jìn)，為進(jìn)一步研究臨床輸血的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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