李喬喬，張麗君，黃志立，王飛，吳振強，王妍

1 華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006

2 深圳職業(yè)技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055

關節(jié)軟骨是高度分化的組織，它的組織結(jié)構(gòu)決定了軟骨細胞代謝緩慢，受損傷后難以自行修復，如果關節(jié)軟骨損傷未得到及時修復，則會造成骨性關節(jié)炎。關節(jié)軟骨損傷及缺損一直是骨科治療的難題[1-2]。目前，組織工程軟骨已在臨床應用方面進行了初步嘗試，為臨床軟骨缺損的修復提供了新的思路與途徑，種子細胞、生物材料以及細胞因子是組織工程軟骨的重要因素。骨髓間充質(zhì)干細胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs) 具有自我增殖能力和多向分化潛能，在特定條件下可分化為軟骨細胞，且移植后能夠與軟骨下板更好地融合，是軟骨組織工程的理想細胞，已有的研究表明細胞因子是定向誘導hMSCs分化成軟骨細胞的關鍵因素，如轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、地塞米松(DEX) 等[3-5]。然而細胞因子的作用是一個復雜的過程，其誘導效應與細胞因子的來源、濃度、劑量等多種因素有關，需要不斷探索新的細胞因子以及各種因子相互作用關系，因此細胞因子對hMSCs誘導分化方向影響及作用機制一直以來都是干細胞研究中的一個熱點。

干擾素 β (IFN-β) 是成纖維細胞和某些上皮細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有抗病毒、抗細胞分裂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性。重組人干擾素β (rhIFN-β) 是通過基因工程改造得到的，對性疣、多發(fā)性硬化癥、丙型肝炎及相關肝癌、其他病毒性疾病以及多種腫瘤具有明顯的療效，雖有研究表明其他亞型干擾素如干擾素γ對細胞增殖和分化有一定的作用，但重組人干擾素β體外對hMSCs向軟骨細胞分化作用的研究尚少[6-8]。本次實驗通過觀察重組人干擾素β1a對hMSCs向軟骨細胞分化的影響，探討重組人干擾素β1a體外是否能夠促進hMSCs向軟骨細胞分化，為軟骨損傷治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

hMSCs細胞株 (賽業(yè) (廣州) 生物科技有限公司)，成人骨髓間質(zhì)干細胞的基礎培養(yǎng)基 (賽業(yè)(廣州) 生物科技有限公司)，成軟骨分化培養(yǎng)基(賽業(yè) (廣州) 生物科技有限公司)，胰酶 (美國Gibco 公司)，Trizol (美國 Invitrogen 公司)，SYBR熒光定量試劑盒 (美國 Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega生物技術有限公司)，內(nèi)參GAPDH(上海康成生物)，兔抗人 CollagenⅡ抗體 (英國Abcam公司)，兔抗人Sox9抗體 (英國Abcam公司)，羊抗兔IgG-HRP二抗 (美國Southern biotech公司)，重組人干擾素 β1a (以色列 ProSpec-Tany公司)，Alcain blue 染色試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，GAG總含量檢測試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

Hera Cell 240型細胞培養(yǎng)箱 (美國熱電公司)，Olympus CKX41型倒置相差顯微成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)，凈安泰 BHC-1000IIA2型生物安全柜 (江蘇蘇凈集團有限公司)，Eppendorf 5810 R 型臺式離心機 (德國 Eppendorf公司)，Spectramax M5e型多功能酶標儀 (美國Molecular Devices公司)，Real-time PCR 儀 (美國 ABI公司)，核酸蛋白測定儀 (德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 hMSCs細胞培養(yǎng)方法

hMSCs細胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、1%5 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青/鏈霉素的成人骨髓間質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基中，37 ℃下于5% (體積分數(shù)) CO2培養(yǎng)箱中孵育至細胞鋪滿瓶底時，用0.25% (質(zhì)量分數(shù)) 的胰蛋白酶消化傳代，于每3天換液，每7天傳代，至第6代用于實驗。

1.2.2 hMSCs成軟骨細胞分化方法

取第6代hMSCs胰酶消化計數(shù)，2 000 r/min離心5 min，用軟骨分化培養(yǎng)基按照5.0×105cells/mL的密度進行重懸。室溫下2 000 r/min離心5 min，吸去上清，分別加入1 mL成人骨髓間質(zhì)干細胞的完全培養(yǎng)基、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅰ (含 10 ng/mL TGF-β3)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅱ (含 100 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅲ (含 10 ng/mL TGF-β3 和 50 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅳ (含 10 ng/mL TGF-β3 和 100 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅴ (含 10 ng/mL TGF-β3和200 ng/mL IFN-β1a) 和成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅵ (含10 ng/mL TGF-β3 和 400 ng/mL IFN-β1a)，室溫下2 000 r/min離心5 min，擰松離心管蓋以便氣體交換，將其放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。自接種開始計算，每隔3 d換液，換液后輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。

1.2.3 GAG總含量測定

收集誘導21 d的細胞，按試劑盒說明測定GAG含量，方法如下：加入300 μL萃取液，充分混勻，56 ℃孵育16 h，90 ℃孵育10 min。13 000 r/min離心10 min，移取上清，置于冰上備用；取25 μL上清加入400 μL染色液，室溫下孵育30 min，避免光照，期間每隔5 min渦旋振蕩15 s，13 000 r/min離心10 min，抽去上清，加入400 μL解離液，室溫下孵育5 min，避免光照。取200 μL樣品，在酶標儀上以656 nm波長測定OD值，每組3個復孔。

1.2.4 Alcain blue染色

取誘導21 d的軟骨球經(jīng)石蠟包埋切片，脫蠟和脫水，阿利新藍染液染色30 min，自來水沖洗2 min，蒸餾水沖洗1次，顯微鏡下觀察阿利新藍染色效果。

1.2.5 熒光定量 PCR檢測成軟骨分化相關基因表達

取誘導分化后細胞，Trizol法提取細胞總RNA，按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green qPCR SuperMix進行熒光定量 PCR擴增，檢測 Collangen Ⅱ和Sox9的mRNA表達，引物序列見表1。每個樣本設3個復孔，在Real-time PCR儀上進行反應。反應條件：50 ℃ 2 min ；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 32 s，共40個循環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因表達的相對水平。

1.2.6 Western blotting檢測成軟骨分化相關蛋白表達

取誘導分化后細胞，按RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液煮沸10 min使其變性。SDS-PAGE凝膠電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，TBST漂洗1次5 min；將 PVDF膜置于含5%脫脂奶粉溶液中室溫搖床封閉1 h，TBST洗膜1次10 min；分別加入含Collagen Ⅱ (1∶1 000)、Sox9 (1∶1 000)、內(nèi)參 GAPDH (1∶10 000) 一抗工作液4 ℃過夜，TBST 漂洗4次，每次10 min；用含標記辣根過氧化物酶的二抗(1∶20 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。將雜交膜置于一透明塑料板上，注意不要讓膜干燥。用移液器將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，并使反應持續(xù)5 min。用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒顯影。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSSl9.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以“平均值±平均標準誤差 (±s)”的形式表示，采用t檢驗，若P<0.05則認為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 GAG總含量檢測結(jié)果

糖胺多糖 (GAG) 總含量是代表hMSCs成軟骨分化水平的重要生化指標。通過檢測細胞的GAG總含量，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)單獨添加10 ng/mL TGF-β3 組和單獨添加 100 ng/mL IFN-β1a 組無顯著差異 (P>0.05)。而 TGF-β3 和 IFN-β1a 聯(lián)合誘導組均高于單獨添加組，其中聯(lián)合添加10 ng/mL TGF-β3 和 100 ng/mL IFN-β1a 組顯著高于其他組GAG含量 (P<0.05)。結(jié)果表明在常規(guī)TGF-β3誘導分化過程添加 100 ng/mL IFN-β1a能夠提高GAG含量，促進hMSCs成軟骨分化程度。

圖1 誘導過程添加不同IFN-β1a濃度對細胞GAG含量的影響Fig. 1 Effect of different IFN-β1a concentration on GAG content during chondrogenic differentiation of hMSCs.*P<0.05; **P<0.01.

2.2 hMSCs軟骨分化形態(tài)檢測結(jié)果

成軟骨立體誘導1 d時可見到離心管底有嵴狀突起形成，在誘導3 d可見突起形成小球狀。輕輕振蕩離心管可見小球在培養(yǎng)液中漂浮，并不散開，隨后小球緩慢增大。21 d后取出小球，小球柔軟略有彈性及一定的粘性。測量軟骨球直徑見圖2，可見常規(guī)TGF-β3誘導分化過程添加100 ng/mL IFN-β1a形成的軟骨球明顯大于其他組單一成分組。

2.3 阿利新藍染色結(jié)果

聚集蛋白聚糖是軟骨細胞表面標志物，該物質(zhì)經(jīng)阿利新藍染色會呈現(xiàn)藍色。hMSCs誘導21 d成軟骨球后，切片、染色，結(jié)果見圖 3。TGF-β3和 IFN-β1a單獨添加組之間無明顯的差異。而常規(guī)TGF-β3誘導分化過程添加100 ng/mL IFN-β1a藍色所占比例明顯提高。組織染色結(jié)果也表明添加IFN-β1a能促進hMSCs成軟骨分化。

2.4 熒光定量 PCR檢測成軟骨分化標志基因表達結(jié)果

添加不同誘導分化培養(yǎng)基誘導4、7、11、14、21 d后，qRT-PCR檢測Sox9和Collagen Ⅱ基因mRNA表達水平。對于 Sox9，在誘導分化不同時間點，與對照組相比，其他各組表達量均顯著高于對照組，且 IFN-β1a 組和 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組均顯著高于 TGF-β3組，但當誘導至21 d 時，只有 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組顯著高于 TGF-β3組 (P<0.01) (圖 4A)。結(jié)果同時表明，隨著誘導分化時間延長，各誘導組中Sox9 mRNA的表達量均有升高，其中TGF-β3組和 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組增加顯著，而IFN-β1a組在第7天有明顯升高，而后隨著誘導時間延長，其表達量上升趨勢不明顯。對于Collagen Ⅱ，其 mRNA 的表達規(guī)律與 Sox9相似，但在第 7天之后，IFN-β組和 TGF-β3組之間表達無極顯著差異，而 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組相對表達量在不同誘導時間點均顯著高于其他組 (圖4B)。

圖2 軟骨球形態(tài)學觀察Fig. 2 Morphological observation of cartilage ball. (A) Blank control group. (B) TGF-β3 group. (C) IFN-β1a group.(D) TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group.

圖3 阿利新藍染色結(jié)果Fig. 3 Alcian blue staining results. (A) Blank control group. (B) TGF-β3 group. (C) IFN-β1a group. (D) TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group.

圖4 Sox9 (A) 和Collagen Ⅱ (B) 的qRT-PCR檢測結(jié)果Fig. 4 qRT-PCR result of gene Sox9 (A) and Collagen Ⅱ (B).

2.5 Western blotting檢測成軟骨分化相關蛋白表達結(jié)果

添加不同誘導分化培養(yǎng)基誘導4、7、11、14、21 d后，收取各組細胞，Western blotting檢測SOX9和COL Ⅱ蛋白表達水平。檢測結(jié)果及灰度(IOD) 分析結(jié)果表明 (圖 5)，在不同誘導分化時間點，TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組的 SOX9 和COL Ⅱ蛋白均顯著高于其他組 (P<0.01)，且隨著分化時間延長，上述兩種蛋白表達呈上升趨勢。而 IFN-β1a組和 TGF-β3 相比較，第 21 天 IFN-β1a組表達的SOX9和COL Ⅱ蛋白顯著高于TGF-β3組，但只有在第11天IFN-β1a組表達的SOX9蛋白顯著高于 TGF-β3組，其他時間點均無顯著差異。而且隨著分化時間延長，IFN-β1a組和TGF-β3中SOX9和COL Ⅱ蛋白表達總體也呈上升趨勢。

3 討論

由于創(chuàng)傷、感染、痛風和退行性病變等各種原因?qū)е碌年P節(jié)長期疼痛和功能障礙，所致關節(jié)軟骨缺損在臨床十分常見，軟骨組織因缺乏血管和神經(jīng)營養(yǎng)而自我修復能力不足，軟骨的缺損經(jīng)常會導致以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成及關節(jié)內(nèi)炎癥為病變特點的骨性關節(jié)炎 (Osteoarthritis，OA) 的發(fā)生[9-10]。體外構(gòu)建組織工程化軟骨是治療軟骨缺損的重要途徑之一，其中骨髓間充質(zhì)干細胞因其具有增殖傳代能力強、細胞均一性好、能夠多向分化、不存在倫理問題和排斥反應等特點[11-12]，已經(jīng)成為體外構(gòu)建組織化工程軟骨的細胞來源之一[13-14]。但體外誘導 hMSCs向軟骨細胞的定向分化需要在一定的誘導條件。細胞因子是誘導分化的關鍵因素，其中細胞因子TGF-β超家族主要包括 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3[15]，廣泛參與包括細胞增殖、分化、黏附、血管形成、骨骼形成和胚胎發(fā)育在內(nèi)的重要生命活動[16-17]。其中 TGF-β3對細胞分化、增殖和細胞外基質(zhì)沉積有重要作用，在組織損傷修復中具有拮抗纖維化的作用，是最經(jīng)典的成軟骨誘導因子，可以促進未分化或分化早期的軟骨細胞增殖[18]，使間質(zhì)細胞向軟骨細胞分化，還可增加Ⅱ型膠原及蛋白多糖的合成[19-20]。因此TGF-β3、地塞米松、維生素 C的聯(lián)合應用是體外誘導 hMSCs向軟骨細胞分化誘導的最經(jīng)典方案。但細胞因子來源、濃度和因子之間的相互作用都對細胞增殖分化有影響，因此需要探索更多細胞因子。

圖5 SOX9和COL Ⅱ的Western blotting檢測結(jié)果Fig. 5 Western blotting result of SOX9 and COL Ⅱ in hMSCs. (A) The immune fluorescent protein electrophoresis figure at five time points. lane Ⅰ: blank control group; lane Ⅱ: TGF-β3 group; lane Ⅲ: IFN-β1a group; lane Ⅳ:TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group. (B) IOD analysis of SOX9. (C) IOD analysis of COL Ⅱ.

干擾素 β (IFNβ) 是成纖維細胞和某些上皮細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有抗病毒、抗細胞分裂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性。目前已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物干擾素有10多個家族，其中人干擾素有7個家族，包括Ⅰ型干擾素α、β、ε、τ、ω、κ，Ⅱ型干擾素 γ[21]，另外，還發(fā)現(xiàn)了干擾素樣蛋白(Interferon-like proteins)，也稱為Ⅲ型干擾素。重組人干擾素 β (rhIFN-β) 是通過基因工程改造的一種糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，根據(jù)表達IFN-β體系的不同，可將其分為CHO細胞表達的 rhIFN-β1a和在E. coli中表達的rhIFN-β1b。國外上市的 rhIFN-β1a 與 rhIFN-β1b比較，rhIFN-β1a活性高、療效好，副反應更少。雖然干擾素一直用于臨床抗病毒治療，但近年的研究也表明干擾素對細胞增殖分化有影響。Irudayam等[6]研究結(jié)果顯示IFN-α激活STAT-JAK通路促進多功能干細胞分化。Diao等[22]研究結(jié)果顯示Ⅰ型IFN在體外增加平滑肌細胞數(shù)。Matatall等[23]發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型干擾素可促進造血干細胞細胞分裂，干擾素γ信號有助于造血干細胞髓樣分化。Hirsch等[24]研究結(jié)果表明在體外低濃度IFN-β能夠降低小鼠神經(jīng)祖細胞 (NPCs) 的凋亡，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞進行直接保護作用，從而治療多發(fā)性硬化癥。而對于研究干擾素β體外對hMSCs誘導分化研究尚少。

糖胺多糖 (GAG) 總含量是代表 hMSCs成軟骨分化水平的重要生化指標。為了確定在常規(guī)TGF-β3誘導分化培養(yǎng)基中添加不同濃度 IFN-β1a成軟骨細胞分化的影響，本研究中首先比較了添加50、100、200、400 ng/mL 的 IFN-β1a后各組細胞的 GAG含量的變化，結(jié)果表明在含有 10 ng/mL TGF-β3的誘導分化培養(yǎng)基礎上添加 100 ng/mL IFN-β1a組顯著高于其他組GAG含量 (P<0.05)，說明IFN-β1a與TGF-β3聯(lián)合使用能夠促進hMSCs成軟骨分化 (圖1)。誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化有平面培養(yǎng)和成球培養(yǎng)，離心管成球培養(yǎng)使細胞間的黏附增殖有利于細胞間信號傳導，為維護細胞的代謝活動提供了適宜的微環(huán)境，聚集成球培養(yǎng)的 GAG、Collagen Ⅱ和 Sox9表達量高于平面培養(yǎng)[25]，hMSCs在成球培養(yǎng)條件下可獲得更強的向軟骨分化的能力[26-27]，因此本次實驗采用了成球培養(yǎng)。采用不同組誘導培養(yǎng)基對hMSCs進行成球成軟骨誘導培養(yǎng)21 d，測量結(jié)果表明，與對照組相比，TGF-β3 常規(guī)培養(yǎng)基組、100 ng/mL IFN-β1a 組、TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組軟骨球尺寸均大于對照組，且 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組軟骨球尺寸最大 (圖 2)。進一步采用阿利新藍染色軟骨球中聚集蛋白聚糖 (Aggreecan)，結(jié)果也表明TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組的染色之后，藍色所占比例增多，說明添加 IFN-β1a之后能促進hMSCs成軟骨分化程度 (圖3)。

除檢測添加IFN-β1a對上述成軟骨細胞組織化學指標的影響之外，本研究在mRNA水平和蛋白水平研究了成軟骨細胞標志蛋白的影響。其中 Sox9是一種高遷移率族蛋白轉(zhuǎn)錄因子，是間質(zhì)祖細胞成軟骨分化早期階段的標志[28]，Sox9不但能結(jié)合并激活非軟骨組織細胞的軟骨基因增強子序列，使之呈軟骨細胞表型[29]，其還能與 Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路相互作用調(diào)控軟骨細胞分化[30-31]。而Collagen Ⅱ是軟骨細胞的主要結(jié)構(gòu)成分，維持細胞的基本骨架，也是軟骨細胞的標志性蛋白，臨床研究中多用于衡量軟骨細胞的數(shù)量和成熟狀態(tài)[32]，因此上述兩者是成軟骨細胞的重要標志物。本研究中的結(jié)果表明，在相同的誘導時間下，TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組中Sox9和Collagen Ⅱ在mRNA水平和蛋白表達水平均顯著高于TGF-β3組和IFN-β1a組，且隨著誘導時間的延長呈上升趨勢。而 TGF-β3組和IFN-β1a組中上述兩種標志因子在相同誘導時間下，并非都有顯著性差異。且隨著誘導分化時間延長總體也呈上升趨勢，但IFN-β1a組在第7、11天后達到一個峰值，分析可能 IFN-β1a在開始階段會強烈地刺激hMSCs的成軟骨分化，隨著時間的推移這種刺激作用會減弱。上述研究結(jié)果表明，在常規(guī)的 TGF-β3誘導分化培養(yǎng)基中添加重組人IFN-β1a能促進hMSCs成軟骨細胞定向分化，且能上調(diào)Sox9轉(zhuǎn)錄因子。但是，其具體的作用機制需要進一步的研究探索，以期為今后重組人IFNβ在細胞分化方面的應用奠定基礎。

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